第4讲DNA的复制机理与PCR技术2-2014资料.pptVIP

Invention 1983, Kary B. Mullis穆里斯 1985, Science Nobel Price in Chemistry 1993;(一)、PCR技术的基本原理;Schematic diagram of PCR;The principle of PCR;DNA片段指数扩增用下式表示： (2n – 2n) × m 式中：n为循环次数；2n是长度不定的初级和次级延伸产物；m是原始模板拷贝数。 ;;(二)、PCR反应所需物质与扩增过程;Taq 酶的活性特点： ① 5′→3′方向的聚合酶活性， ② 5′→3′方向的外切酶活性， ③ 逆转录酶活性， ④ 较弱的非模板依赖性， ⑤ 缺乏 3 ′→ 5 ′方向的外切酶活性。;(2) 保真性：;2. 其他耐热DNA聚合酶：;3. PCR引物：;④ 两个引物间不应有互补性，避免形成二聚体。引物自身也不应存在互补序列，避免自身折叠形成发夹结构或本身复性。 ⑤ 引物3′是延伸的开始，因而不能进行任何修饰，不能形成二聚体，以免浪费引物。 ⑥ 引物3′端要求是非简并性密码子，密码子的第三个碱基不应具有摇摆性。 ⑦ 引物5′限定了PCR产物的长度，但对扩增特异性影响并不大；当在5′最多添加10个碱基时对扩增并无严重的影响；因而可根据不同的试验目的对5′进行不同的修饰。以便于PCR产物的分析克隆。;用户