基因工程第三章1.pptVIP

第三章 基因工程载体;定义：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。; （1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 ;载体 的种类;第一节 质粒载体 ;氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增，其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应;严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）： 只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子（1-3拷贝）,如F因子。;基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。; 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的 不同质粒，不能在同一个寄主细胞系中稳定地共 存的现象。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被 逐渐地排斥（稀释）掉。 ;4、携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使寄主生 物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性：抗生素、重金属、毒性阴离子等 物质合成: 细菌毒素、有机碱 Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm;5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 ;7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单;Review;合适的出发质粒;3. 人工构建的质粒载体的类型;（2）低拷贝数的质粒载体;（4） 插入失活型质粒载体;（5）正选择的质粒载体 ;（6） 表达型质粒载体;表达载体的结构;四、经典的大肠杆菌质粒载体;2. ColE1;;EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。;3. pBR322：;;pBR322的优点;;;Amp;氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copies;4. pUC系列;（1）元件来源;（2）克隆位点; IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，乳糖类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导lacz’所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段的合成。 x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal 蓝色;菌落蓝白选择：暴露于IPTG的细菌可同时合成半乳糖苷酶的两种片段，使此酶具有活性，铺在含有生色底物x-gal的培养基上将形成蓝色菌落，外源基因插到质粒的多克隆位点后，可使半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，破坏了互补作用，因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。 ;菌落蓝白选择;优点：;3.EB浓度达到饱和时，超螺旋质粒DNA分子密度 大于线形和开环的质粒DNA，从而分开。;用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加入含EB的CsCl中超速离心 在紫外灯下吸取cccDNA 并稀释沉淀cccDNA;　　（1） 将菌体悬浮浮在含有EDTA和Triton X- 100的缓冲液中 （2）加溶菌酶破细胞壁 （3）放入沸水浴中煮40秒　（4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物（白色沉淀）　（5）异丙醇沉淀，乙醇洗涤。;第二节 噬菌体或病毒DNA;一、大肠杆菌的λ-噬菌体DNA;（2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因;λ噬菌体基因大致分为4个区： ;3、感染周期（溶菌循环）; 头部包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，A蛋白切割cos位点。;4、溶源状态的建立;噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体。 适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。 ;;插入型载体、取代型载体 ;插入型载体（insertion vector）;取代型载体（substitution vector）;插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。 ; 删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有 5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重 组操作，必须删除至1-2个. 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还 需要增加一些单一的酶切位点. ;3、灭活某些与裂解周期有关的基因;4、加装选择标记;(1)免疫功能失活标记 (cI筛选);(2)加装选择标记lacZ（蓝白斑筛选）;5、建立?-噬菌体的体外包装系统;;（三）λ-DNA作为载体的优点;（一）柯斯质粒的构建 考斯质粒：一类人工构建 的含有λDNA两端cos序 列和质粒复制子的特殊类 型的载体。 ; ;“柯斯克隆” （cosmid cloning）;（一）