第17章重组总结.ppt

DNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新组合，称为重组（recombination）。重组的产物称为重组DNA（recombinant DNA）。由于重组，一个DNA分子的遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一起，也可以改变一条DNA分子上遗传信息的排列方式。DNA重组广泛存在于各类生物中，说明重组对物种生存具有重要意义。通过重组可加快物种变异的过程。此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复中发挥重要作用。;DNA重组包括: 同源重组（homologous recombination） 位点特异性重组（site-specific recombination）;1、同源重组（homologous recombination）; 两条同源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下,在相同位置上同时切开。在切口处发生链的交换，形成所谓的连接分子（joint molecule），也称Holliday结构（Holliday structure）。分支点可以发生移动，称为分支迁移（branch migration），分支迁移的结果是在两个DNA分子中形成异源双链区（heteroduplex）。;重组体;1.2、Meselson-Radding 模型;1.3、同源重组的双链断裂模型（P530);Holliday 中间体是否真的存在？ 从细菌和动物细胞中可以分离出正在发生重组的质粒和病毒DNA。从它们的电镜照片上，我们可以发现与Holliday中间体的交叉结构和围绕着交叉点旋转形成的Holliday异构体。;1.2、同源重组的分子机制;RecBCD通路 RecBCD与dsDNA的末端结合，然后以大约每秒1000 bp 的速度解开DNA双链，同时降解解旋产生的ssDNA。RecBCD对两条单链的降解速度是不一致的，它优先降解3’末端链。一个正在被RecBCD加工的DNA的末端会形成一个5’端拖尾。 ;Chi位点 RecBCD的酶活性受重组热点Chi的调节。Chi位点大肠杆菌基因组中的一种不对称的8 bp核苷酸序列，5′-GCTGGTGG-3′，Chi位点能够改变RecBCD的酶活性，它是大肠杆菌重组过程的必需组分，是重组的热点。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。但是它的解旋酶活性未受到影响。 RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNA。;单链的侵入（strand invasion） 由RecA蛋白介导。RecA是一种单链DNA结合蛋白，参与大肠杆菌中所有的同源重组事件。它催化一个双链DNA分子的3′末端单链区侵入另一个双链DNA分子，形成异源双链区，同时置换出同源单链，形成Holliday结构。 RecA介导的链交换可以分为三个阶段： RecA聚集在ssDNA上形成丝状结构的联会前阶段； RecA－ssDNA丝装结构寻找同源双链DNA分子并与之配对的联会阶段，在这一阶段可能形成三螺旋（triplex）结构； 发生链的交换，形成连接分子的阶段，入侵的单链置换出双链中的同源单链，产生一个长的异源双链区。 ;分支迁移和Holliday中间体的拆分 分支迁移由结合在Holliday分支点上的RuvA和RuvB蛋白催化。RuvA以四聚体的形式识别并结合到Holliday分支点上。RuvB蛋白为催化分支迁移的解旋酶，但RuvB自身不能有效地与DNA结合，它需要与RuvA一起起作用。RuvC蛋白催化断裂反应，切开极性相同的两条单链，拆分Holliday中间体。;1.2.2、真核细胞的同源重组;1.2.3、DNA修复和同源重组（P533）;二、位点特异性重组;1、λ噬菌体（P534）;2、位点特异性重组在基因工程中的应用;三、转座; 转座子的类型： a.复制型DNA转座子 b.保守型DNA转座子 c.逆转录元件 ;1??复制型和保守型DNA转座（P538);2、逆转录元件的转座; 反转录转座子被划分为二个主要类群：含LTRs的转座子和不含LTRs的转座子。 (1)含LTRs的转座子，又称为病毒型反转录转座子。这类转座子在结构上与反转录病毒的基因组相似，都具有250～600bp长末端重复（long terminal repeats, LTRs）。 LTRs反转录转座子与反转录病毒的基本区别是LTR反转录转座子缺少反转录病毒的包膜蛋白基因，因此