PCR的原理.docVIP

PCR的原理： 在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 要素： １.要被复制的DNA模板。２.界定复制范围两端的引物。３.DNA聚合酶。4.合成的原料及水。 主要步骤： 1.将DNA加热变性， 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 2.令于一定的温度下附着于模板DNA两端。 （1 序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 3．操作简便易行 4.用途广泛：医学，法医，考古等等领域 反应条件： 1.反应成分： 1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 （2）引物浓度 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5）Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 2 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 应用： 基因克隆 基因检测 基因配型 基因鉴定 基本步骤为： i、设计一对引物，以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异性产物。 ii、优化反应体系，以便获得最佳的扩增效果。体系组成：模板、引物、4种dNTP、TagDNApolymerase、Mg2+. iii、选择3个温度下进行热循环 a.变性,94oC，45～60s； b.退火（根据引物与模板的Tm值定）1min； c.延伸，72oC，1min。开始时热变性5～10min，热循环25～30个周期，最后延伸10min。 iv、扩增完成后，取出一定量反应产物，检查扩增结果。通常扩增106倍。 电泳（加溴乙锭），紫外灯下观察。 采用双脱氧DNA序列分析法对一个克隆得到的DNA 片段进行序列分析，放射自显影结果如右图： ?写出这个DNA片段的核苷酸顺序，标出5′和3′端。 ?重组DNA方法的关键技术。?为（氟标签）自动方式的发展使得人类基因组测序。