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一 基因工程建立的理论基础：确定了生物遗传的物质基础是DNA，DNA双螺旋结构模型的建立，遗传信息传递中心法则的建立。标志基因工程诞生的实验：Boyer-Cohen实验 技术基础：限制性内切酶，DNA连接酶，载体，感受态体系，琼脂糖凝胶电泳 二 1.细菌限制修饰系统类型：I型限制－修饰系统；II型限制－修饰系统；Ⅱs型限制修饰系统； III型限制修饰系统 2.限制性内切酶的命名规则：①用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名②用一个右下标的大写字母表示菌株或型③如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示 3.连接酶连接策略或方法①载体去磷酸化②连接体与衔接体③同聚物加尾 4.E.coli DNA聚合酶I的特点、主要用途 主要功能：①5‘-3’的聚合作用② 校对及3‘-5’的外切作用③ 5‘-3’的外切作用 三 1.复制子定义：包括复制起点、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗传单元。 2.质粒不稳定性的两个方面及含义、分配方式。质粒不相容性的含义。 两个方面及含义: 分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNΑ的重排与缺失。 分配方式：主动分配。平均分配，配对位点分配；随机分配。 质粒不相容性的含义：用同一复制系统的两种质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在同一个细胞中不能和平共处。 3.α互补筛选原理 ①载体携带大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸（ N端，称为 肽）的编码信息。 ②宿主菌缺失lacZ基因的起始氨基酸（met , 导致翻译在后续met处开始，其产物为β-半乳糖苷酶的C端，称为ω肽） ③ 肽段无催化能力，但可使ω肽段正确折叠并形成稳定的四聚体；ω肽段单独无法正确折叠，因此两个肽段在一起才具有催化活性，这称为 互补。 ④ 载体的 肽编码序列中还插入一个不破坏阅读框的多克隆位点（MCS）， 由MCS编码的少数几个氨基酸插入到 肽的氨基端不会影响其功能，然而，当外源DNA插入MCS后，几乎不可避免地导致其功能丧失。 ⑤空载体进入宿主后在IPTG诱导下实现 互补， β-半乳糖苷酶分解X-Gal产生蓝色物质，菌落为蓝色；连接有插入片段的载体在IPTG诱导下无 互补作用， X-Gal不被分解，菌落为白色 4.λ噬菌体载体的特点、种类和克隆策略、 特点：①有长度限制:必需区长28Kb②有相当长的感染非必需序列③限制性酶切位点过多④可插入的长片段DNA，适合于构建cDNA文库或基因组文库。⑤克隆操作要比质粒载体复杂 种类：①插入型载体②替换型载体 克隆策略、体外包装的大致过程? 5.柯斯载体定义、特点、克隆的一般过程 定义：是一类人工构建的含有 噬菌体cos位点和质粒复制子的特殊类型质粒。 特点：①具有 噬菌体的特性②具有质粒载体的特性③具有高容量的克隆能力④具有与同源序列的质粒重组的能力 克隆过程：①限制酶切割载体和外源片段②两种片段混合连接③体外包装④感染宿主⑤质粒环化、复制 6.M13载体的特点：优点：①包装长度大②可大量重组RFDNA③可制备大量单链DNA④可表达超量阻遏蛋白⑤便于筛选重组DNA 缺点：插入片段的长度有限 7.酵母常用质粒及一般特征 ①整合型载体②复制性载体③着丝粒载体④附加型载体 特征：具有被E.coli识别的复制子和相应的标记基因；含有在酵母中使用的标记基因；具有合适的限制性内切酶位点 8.人工染色体的定义、种类 指人工构建的含有天然染色体基本功能单位 包括复制起始点、着丝粒和端粒 的载体系统。 种类：细菌人工染色体，P1派生人工染色体，酵母人工染色体，哺乳动物人工染色体，人类游离人工染色体 9. 杆状病毒/昆虫表达体系的特点： 优点：①蛋白表达水平高②表达产物活性高③可以进行翻译后的糖基化④表达的重组蛋白可以分泌到胞外⑤载体容纳大片段的能力强⑥安全性好 缺点：糖基化作用不完全，模式也和高等真核生物有区别 10. Ti 质粒定义、结构、载体类型和克隆一般过程 Ti 质粒是存在于土壤农杆菌中的一种质粒，可以使植物形成冠瘿瘤，因此称为肿瘤诱导质粒。 结构：①T-DNA②毒性基因③冠瘿碱代谢基因④不相容性基因。 类型：① 共整合载体②双元载体。 过程：（不确定）外源基因（插入）→Kan pBR322（转化）→土壤农杆菌含pGV3850→（卡那霉素筛选/pBR322与pGV3850重组）→含重组质粒的土壤农杆菌（感染）→植物组织→（整合到染色体上）→（胭脂碱筛选）→外源基因表达鉴定