PCR技术及其应用张静重点.pptVIP

第八章 PCR技术及其应用;前言 PCR技术简史;;ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC;ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC;ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC;;引物;Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus);72℃;一、PCR的基本原理;Target Amplification;二、PCR反应体系;1 缓冲液;2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs) dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。 dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。;PCR引物的设计一般原则 1.引物长度一般以18～30bp为宜。 2.解链温度(Tm值) 直接决定了退火温度(Ta值)的高低。两条引物间的Tm值越接近越好。 3.避免引物内部出现二级结构。 ;4.要避免引物自身或引物间特别是3’末端碱基序列互补。 5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布。 6.引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C或T时引发效率较高。 7.引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。;4、模板 单、双链DNA均可。 模板纯度不高（混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类）往往是限制PCR扩增的重要因素。 一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果。 不同属性的模板所加的理想的量不同。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。;5、耐热性的DNA聚合酶 均从耐热性的细菌中分离出来，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’外切酶活性、耐热性和附加功能上有差异。常用的有： 1）Taq DNA聚合酶：最常用，95℃时的半衰期为40分钟，75℃时活性最强，没有校正功能。 2）Tth DNA聚合酶：95℃时的半衰期为20分钟，74℃时进行扩增，在MnCl2催化下的高温反转录功能。 3）Vent DNA聚合酶：100℃时的半衰期为1.8小时，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。; 4）Pwo DNA聚合酶：100℃时的半衰期大于2小时，有校正功能，保真度高。 5）Pfu DNA聚合酶：具有极高的热稳定性，目前公认是最保真的。 6）混合DNA聚合酶：将具有校正功能的酶与Taq酶按一定比例混合，具有类似Taq的强启动合成能力，同时又有一定的保真度，而且具有一定的扩增长片段的能力。 Taq酶的延伸速度为1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min来预计。 ;三、PCR反应程序 1、常规程序： 94℃左右预变性几十秒至几分钟； 94℃左右变性5秒至1分钟； 50-65℃左右退火30秒至1分钟； 72℃左右延伸30秒至几分钟； 72℃左右最后延伸和加尾3-10分钟； 4-25℃保持3分钟或更长。;*;3、反应时间： 变性步骤一般为5秒至1分钟。 退火时间一般为30秒至1分钟即可。 延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。Taq扩增时按1kb/min计算，具校正活性的酶则按0.6-0.7kb/min计算。 4、循环次数： 多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率、DNA聚合酶的扩增能力。;5、PCR反应液的配制： 加试剂顺序：双蒸水、缓冲液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。 酶要用冰盒取放，禁止因手的接触或暴露于空气中而使酶升温。 第一次使用各试剂时要轻柔充分混匀。 正确保存各种试剂，尤其是要避免核酸因反复冻融而降解，各试剂宜分装成适量的小管。;PCR仪;;;模板DNA;;;;;;;PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA;PCR中其它注意的事项;第二节 PCR产物的克隆;二、A/T克隆 这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。 Ta