第十一章动物细胞培养技巧.ppt

第十一章 动物细胞培养;培 养 板;;一、培养细胞的生物学特征;1、贴壁型细胞 细胞能附着于底物(支持物)表面生长。 靠贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞(anchorage-dependent cells)。;;概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以 机械方法使保持悬浮状态下生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，且能繁殖更多细胞，适合大量生 产，有工业应用价值；传代繁殖方便，传代时只 需稀释，无需消化处理，易于收获，便于做细胞 代谢等研究 ;（二）、体外培养细胞的生长特点 1、贴附并伸展 这是大多数体外培养细胞的基本生长特点。除悬浮型细胞外，大多数细胞都可贴附在某些支持物上，并逐渐伸展而形成一定的形态 。; 2、接触抑制 正常的细胞不停的活动或移动，但是当两个 或几个细胞由于运动相互接触时，细胞不在 移动。这种由细胞接触而抑制细胞运动的现 象称为接触抑制（contact inhibition). 癌细胞没有接触抑制现象，细胞可以堆积生长;; 3、密度依赖性 当细胞贴附生长、汇合成单层时，细胞变得较为拥挤，而扁平形状的程度减少，与培养液的接触面减少，同时，培养液中的一些营养物逐渐消耗掉，此时形成单层的细胞分裂活动停止，须赶快换液传代，否则将影响细胞生长增殖。这种生长特性为密度依赖性调节。;（三）、培养细胞的生长和增殖过程 1、单个细胞的细胞周期 细胞在细胞周期中经过的顺序过程为G1→S→G2→M期。 2、培养细胞的生命周期 所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中 持续增殖和生长的时间 进行正常细胞培养时,细胞的生存过程大致经历 三个阶段 ;细胞生长曲线;（1）、原代培养（Primary Culture）期：a.即初代培养期，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。 b.此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。 c.初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。 d.细胞群是异质的（Heterogeneous），细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。 e.初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。 ;(2）．传代期：a.初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。 b.在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。 c.为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。 当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 ;(3)、衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。 ; 在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。 细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。 细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。 ;要明确的概念 细胞系：初代培养细胞经第传代后的细胞群体。分为有限细 胞系和无限细胞系。 细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞群中筛选出来的单个 细胞增殖形成的细胞群.即通过克隆法得到的细胞群体。 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得 具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。 ;3、组织培养细胞一代生存期 　所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。 如某一细胞系