3基因操作的主要技术原理重点.ppt

第三章 基因操作的主要技术原理;第一节 核酸的分离与纯化;一、核酸分离提取的原则;核酸提取的基本要求;提取核酸的一般程序:;二、质粒载体的分离与纯化 ;变性法提取质粒DNA的原理;碱变性法提取质粒DNA的步骤;关键：尽可能地保持其高分子量 细菌 3300~4200kb 酵母 15,000 kb 果蝇 1.65x105 kb 人 3x106 kb 植物 2x105~1x108 kb 天花病毒 288 kb 痘病毒 196 kb;CsCl密度梯度离心;;质粒; 关键： 防止内外源RNase的作用 ;RNase的特点：;解决办法：;五、核酸的浓缩与贮存 ; ;六、核酸的质量评估方法 ;;第二节 凝胶电泳;琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 ;核酸电泳的染色剂和指示剂 ;;在常规电泳中，DNA移动距离与分子量有关：分子量小的移动快，反之则慢 大于20kb的DNA大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些DNA分子要通过胶孔时???须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。 ; 在脉冲场凝胶电泳中，加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的DNA分子用于改变泳动方向的时间不同，则可以得到分离 ;;;;第三节 DNA序列分析;;基本原理：;过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影 ;DNA Sequencing Reactions; 4 different DNA synthesis reactions are run begin synthesis from specific priming point add components for DNA synthesis + specific ddNTP for each of the four reactions…e.g. ddATP;ddCTP;Method from Saenger ? Manual sequencing uses radiolabeled dATP (35-S or 33-P) to label the DNA.? The sample is then split into four tubes? each with an individual ddNTP present.? The samples are then subjected to acrylamide gel electrophoresis followed by autoradiography.;DNA全自动测序;Putting It All Together; 屏幕显示的胶图;Raw Automated Sequencing Data;Sanger：荧光检测; ;上样走电泳;全自动的测序仪器：MegaBace; 华大基因研究中心(北京) ;TADA!!;;4种反应体系中，化学试剂特异断裂DNA机制;;;;;作 业; A cloned fragment of DNA was sequenced by using the dideoxy method. A part of the autoradiogram of the sequencing gel is represented here Deduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain synthesized from the primer. Label the 5′ and 3′ ends Deduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain used as the template strand. Label the 5′ and 3′ ends Write the nucleotide sequence of the DNA double helix (label the 5′ and 3′ ends);第四节 分子杂交技术;核酸杂交; Southern杂交 Southern杂交是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术，用于特定DNA序列的检测，包括基因组特定DNA序列的定位，相关片段的同源性测