代谢工程与调控第五章重点.pptVIP

第七章 支架技术及RNAi;目录;支架技术;代谢途径的中间产物可能对宿主产生毒性，被竞争途径消耗，或通过分泌丢失。 解决这些问题的一个新兴的策略是将合成途径的酶组合成多酶复合物。 多酶复合物在自然界中很常见，例如：由丝氨酸合成色氨酸的反应过程中，催化色氨酸合成的最后两个步骤的酶可以形成复合物，中间产物吲哚通过一个通道由一个活性位点到达另一个。 ; ; ;将合成途径的酶组合成多酶复合物是将途经中的酶共定位形成最优比例的复合物，可以增加途径代谢产物和酶的局部浓度，限制途径中间体的积累，减少与其他细胞成分之间不必要反应的发生。 将酶组合成复合物的一种方法是将催化连续反应的酶进行融合。 酶-酶融合策略在某些情况下能够增强途径通量。但是其存在以下缺点： ①不适用于包含超过两个酶的途径； ②融合之后经常会导致一个或者两个酶活性的降低； ③不能轻易地改变复合物中酶的比例。 ; ;;蛋白质支架的应用---甲羟戊酸的生物合成; 三种酶的活性不同，存在 HMGS 和 HMGR 之间流量不平衡的问题，导致中间产物羟甲戊二酰辅酶 A( HMG-CoA )的积累。 HMG-CoA 对宿主大肠杆菌细胞具有很强的毒性。 ;通过蛋白质支架将 HMG-CoA这个中间产物的产生酶(HMGS)和消耗酶(HMGR)之间共定位。调节两个酶的比例，使甲羟戊酸的产量提高了 10 倍。 通过另外一个支架分子将途经的第一个酶(AtoB)引入到复合物中，使甲羟戊酸的产量较无蛋白支架的对照提高了 77 倍。 ;蛋白与蛋白的相互作用区域与配体来自于动物细胞 SH3 和 PDZ域-----mouse GBD域----rat 将其插入到大肠细胞中，设计调节机制 蛋白支架上结构域的数量直接控制酶的比例 ; 途径中的限速酶是HMGR， 需要增加羟甲戊二酰辅酶A 到甲羟戊酸这一步的流量。 HMGS的C端可以与不同数量 的SH3配体结合，HMGR的N端 可以与一个SH3配体结合， 从而形成不同酶比例的酶复合物;;九个不同的多酶复合物表现出很大的差异，最终GBD1SH32PDZ2 多酶复 合物相比于无支架的酶，产量提高了77倍;蛋白质支架的应用---葡糖二酸的合成;;DNA支架应用---用于GOx和HRP;组装的DNA纳米结构，由单条的核苷酸链组成，每条链预先设计好互 补序列，通过杂交可以形成六边形结构。剩余的10个碱基相当于一个 铰链，可以使得DNA支架与生物大分子结合。 (注意：将此结构描述成六边形是为了阐明DNA自主装结构的形式，实际情 况下，该结构会发生扭曲，但由于杂交，它们保持环状结构）;酶与DNA支架结合;分别以两个六面体和四个六面体的DNA结构作为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的DNA支架 当酶的间距由从 4 个六面体 (约 33 nm)缩短到2 个六面体(约 13 nm)， 产物的产量有了显著的增加。 原因：距离远使得生成的H2O2扩散到体系中，导致HRP活性位点周围的H2O2浓度较低，从而最终产量低;;;; RNA 支架(D0)结构模块中包含 PP7 和 MS2 适配体域用于结合 PP7(氢酶)和 MS2(铁氧化还原蛋白) ;RNA结构中包含二聚区域(DD) 和多聚区域(PD)，为了防止回 文序列的倒塌;将带有两个蛋白适配体域的RNA支架与组装结构结合，自组装之后形成 纳米管最终形成一维RNA支架;;RNA干扰;RNA interference 的发现;法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因“沉默”的原因在于RNA干扰。 实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线虫中观察到(RNA干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。 √1995年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯(Kenneth　Kemphues)指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义和正义这两种单链RNA都阻断了该基因的表达。 √1998年，卡耐基研究院 Andrew Fire的研究证明， 在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是微量双链RNA（污染）。是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对 基因表达的阻断作用被称为RNA干扰。（RNAinterference,RNAi）。 ;可惜的是，郭苏和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到3年后，法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得RNA污染了微量的双链RNA，而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是RNA干扰。　 郭苏后来到加州大学旧金山分校（UCSF）任职。她说：“他们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞跃……我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁·法尔和克雷格理应获奖。” 启示：在实验时，要认真观察每个现象，发