第六章酶分子的化学修饰介绍.pptVIP

第五章 酶分子的化学修饰;酶的修饰;酶的化学修饰：在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。 ; 意义： 1.基础酶学的研究； 活性部位的研究 一级结构的测定 测定酶分子中某种氨基酸的数量。 结构与功能的关系 ;2.提高生物活性； 3.增强稳定性； 4.产生新的催化能力; 5.解除免疫原性； ;第一节酶分子的修饰方法;;例： α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰一NHCH2COOH后，稳定性在60℃可提高1000倍。 马肝醇脱氢酶的赖氨酸的乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力，同时酶稳定性也提高许多，底物专一性也有所改变。 ;（二）大分子修饰 可溶性大分子：如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、右旋糖苷、环糊精、肝素等。 ;例： PEG修饰的L-天冬酰胺酶免疫原性显著降低、半衰期延长。 天然过氧化氢酶在6h内很快从血液中被去，PEG修饰后，酶活力在血液循环中可保持72h 右旋糖苷修饰α-淀粉酶：60℃,t1/2：3.5min；修饰后：175 min MPEG修饰过氧化氢酶，三氯乙烷中酶活是原来的200倍。 ;（三）交联修饰 使用双功能或多功能试剂将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联。 （四）固定化修饰 ;例： 枯草杆菌蛋白酶交联酶晶体，其酶活提高13倍。 葡聚糖二乙醛交联青霉素G酰化酶，55℃下的半衰期提高9倍。 丝氨酸氨白酶、胰蛋白酶通过交联修饰，最适温度从45℃提高到76℃。 ;小分子修饰：稳定性增加及一定催化特性的改变。 大分子修饰：稳定性增加；提高在非水相中的催化能力；免疫原性与抗原性降低、延长半衰期。 交联修饰：提高其稳定性，增加酶在非水溶液中的使用价值。 ;二、酶分子的内部修饰 （一）催化活性基团的修饰 产生新的催化能力 硫代烷基化反应，枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser转化为半胱氨酸，对肽或酯无水解能力，但能水解硝基苯酯。 化学突变：将一种氨基酸侧链化学转化为另一种新的氨基酸侧链的方法。 ; （二）非催化活性基团的修饰 改变酶的动力学特征、影响酶的专一性。 胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亚砜，该酶对含芳香族或大体积脂肪族的专一性底物的Km提高2-3倍。 ;（三）?? 蛋白质主链的修饰 依靠酶法，水解部分酶片断。 天冬氨酸酶有限水解切去10个氨基酸后，酶活提高5.5倍 ; （四）?? 与辅因子相关的修饰 1．依赖辅助因子的酶 ①??辅因子共价结合在酶上； NADH共价结合到醇脱氢酶，活力为原来的40%,但解决了辅因子循环利用的问题。 ;②引入新的辅因子或对辅助因子进行修饰。 例：黄素共价结合在木瓜蛋白酶上，从而将蛋白酶转变成氧化原酶。 修饰辅助因子，可创造出多种多样的新酶。 ;2.金属酶中的金属取代 酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。 例：酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌被钴取代后，酶的底物专一性和最适pH都有改变。 ;第二节???酶蛋白侧链的小分子修饰;5，5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）(Ellman 试剂) ，反应生成的阴离子在412nm处有最大吸收。定量酶分子中巯基数目最常用的试剂。 N-乙基马来酰亚胺(NEM)：反应专一性很强的疏基修饰剂，反应产物在300 nm处有最大吸收。;二、氨基的化学修饰 烷基化试剂： 碘代乙酸 三硝基苯磺酸（TNBS）：与赖氨酸残基反应，420nm，367nm能产生特定的光吸收。 磷酸毗哆醛(PLP)是一种非常专一的赖氨酸修饰试剂，反应可通过325nm处光吸收定量。 ;2,4-二硝基氟苯（DNFB）法(又称sanger试剂)； 丹磺酞氯(DNS)法； 苯异硫氰酸酯(PITC)法。 用于多肽链N-末端残基的测定的化学修饰方法。 ; 三、羧基的化学修饰 水溶性的碳二亚胺类特定修饰酶的羧基已成为最普通的标准方法， 在一定条件下，丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸也可以反应。 ;四、咪唑基的化学修饰 焦碳酸二乙酯(DPC)和碘代乙酸。 DPC对组氨酸残基有较好的专一性，产物在240nm处有最大吸收，可跟踪反应和定量。 DPC还可能修饰巯基，用连四硫酸钠或连四硫酸钾对巯基进行可逆地保护。 ;五、吲哚基的化学修饰 N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)：产物可通过280 nm处光吸收的减少跟踪反应。 2-羟基-5-硝基苄溴(HNBB)和4-硝基苯硫氯对吲哚基修饰比较专一。但易与巯基作用，修饰时应对巯基进行保护。 ; 六、二硫键的化学修饰 二硫苏糖醇（DTT） 巯基乙醇 ; 七、酚基的化学修饰 四硝基甲烷（TNM）：最常用的具高度专一性酪氨酸残基的修饰剂。 苏氨酸和丝氨酸残基：一般都可被修饰酚