RNA抽提与反转录步骤x.docVIP

RNA抽提步骤 准备： DEPC水配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置后备用。配成终浓度为0.1%，室温搅拌过夜，121℃高压20min，4℃密封保存。注：DEPC属于一种致癌物质，易挥发，要小心并在通风橱中操作，高压后就会分解，其毒力消失。 加Trizon裂解细胞：加入适当量的Trizol至细胞中（直接加入去培养液平板中后用枪吸出，亦可细胞刮下后离心去上清再加，用量约1ml Trizol每3×106、cells）。贴壁细胞在遗弃培养基后，可以直接加入Trizol（按10cm2 / 1ml Trizol的比例）裂解，匀浆一定要彻底。反复吹打以打碎细胞结块，室温放置5min，使其充分裂解。（注：此时可以-80℃长期保存） 4度，12000g×5min离心弃沉淀。 萃取除杂蛋白：加入0.2体积的氯仿，立即剧烈摇动充分混匀。混匀后冰上放置15min。(注：禁用漩涡震荡器，以免基因组DNA断裂，造成基因组DNA污染) 4℃，12000g，离心15min，此时溶液分为三层：下层的酚-氯仿，白色浑浊的中间相多为变性蛋白，水相（RNA所在相），小心吸取水相（宁可损失，也不要吸到中间相），转移至另一干净RNaseFree EP管中；一般水相的体积为Trizol的60℅. 异丙醇沉淀：向水相中加入0.5倍体积（相对于Trizol）的异丙醇，充分混匀，混匀后置于-2