第3章 初级分离.pptVIP

思考题 常用的沉淀法有哪几种？简述各自的沉淀机理。 生产中常用的盐析剂有哪些？其选择依据是什么？ 何谓分步盐析沉淀？ 有机沉淀法与盐析沉淀法相比有何优缺点？ 初级分离 定义：从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程 特点：体积大、杂质含量高，浓缩倍数高、操作简便、经济、纯化倍数低等 技术：沉降、过滤、膜分离、萃取、吸附、沉淀分级、泡沫分离 1）蛋白质沉淀分级原理，沉淀方法分类，影响溶液稳定性有哪些因素？ 2）盐析概论及影响盐析效果主要有哪些因素？ 3）有机溶剂沉淀机理及影响因素。 1 沉淀分级 定义：物理 环境的变化引起的溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象 常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出。沉淀具有浓缩与分离的双重作用。 与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。 区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。 优点 设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； 原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； 使中间产物保持在一个中性温和的环境； 及早地将目标蛋白质.从其蛋白质.水解酶分离出来，避免蛋白质降解，提高产物稳定性； 用沉淀法作为蛋白质色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。 缺点： 沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低； 过滤较困难 蛋白质溶解：相似者相溶 亲水性和疏水性： 1) 水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g 蛋白质) loose hydration shell(2g water /1g 蛋白质) 2) 静电排斥 ? zeta电势 Nernst Potential—胶核表面电位(不可测) Stern Potential—(不可测) ? Potential—滑面电位(可测,mobility) ?电位 Nernst电位 ionic strength 3) |pH水 – pI| Value |pH水 – pI| Value? zeta电势? 水化层? 静电排斥? 蛋白质沉淀方法 1）原理 降低水化层厚度 降低双电层厚度（ζ电位） 2）关联因素 电解质种类、浓度、pH等 1.2 盐析沉淀 定义——在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解度降低而产生沉淀的过程 蛋白质生理离子强度范围：0.15～0.2mol/kg 2) 影响因素 无机盐种类 浓度 温度 pH 溶液pH影响?值 pH接近PI时，?最小，S最小 方法: A、 “Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的。 B、“β”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。 C、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法。 盐析操作方式及方法 操作方式 固体盐加入 饱和盐溶液加入 饱和度 方法 分步盐析 重复盐析 反抽提法 盐析沉淀法的特点 沉淀条件温和，不会引起生物物质变性失活； 非蛋白的杂质夹带沉淀很少； 适用范围广； 盐份含量高。 1.3 等电点沉淀法 1）定义—利用两性生物物质在等电点时溶解度最小而析出固相物的过程 2）沉淀机理—降低排斥电位和水化程度 3）盐离子的影响—使实际等电点 pI偏离（±0.5） 与阳离子结合， pI升高 与阴离子结合， pI降低 等电点沉淀法中的pH值作用于β值而隐含在Cohnx公式中，pI值通常在pH4~6范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂。 在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效。为了提高等电点法的沉淀能力，常将其与盐析法、有机溶剂法或其他沉淀法一起使用。 特点：沉淀条件温和；不引入新的物质；沉淀效果差。 最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。 1.4 有机溶剂沉淀法 同盐析一样，随着沉淀剂——有机溶机浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降。 机理： A、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝集和沉淀。 B