酶的活性.pptVIP

§4 核酸的理化性质 §4 核酸的理化性质 §4 核酸的理化性质 §4 核酸的理化性质 在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针技术(Probe)。 探针技术在遗传性疾病诊断上已开始应用。 例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取DNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状 §4 核酸的理化性质 的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNA后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。 杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。 §4 核酸的理化性质 一、分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。 保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。 （一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则： §4 核酸的分离纯化、测定及研究方法 （二）核酸的纯度要求 ① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； ③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 §5 核酸的分离纯化 （三）核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； ② 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行； §5 核酸的分离纯化 ③ 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； §5 核酸的分离纯化 ④ 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。 机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。 §5 核酸的分离纯化 二、核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解 核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 §5 核酸的分离纯化 三、核酸的测定方法 1、紫外吸收法 在一定pH下测定样品的紫外吸光度（A260），即可由下式计算样品中的核酸含量： C=Mr×A260/ε×L 其中：C为核酸的含量（mg/mL），Mr为相对分子质量，A260为核酸溶液的吸光度，ε为摩尔消光系数（即1升溶液中含1摩尔核酸的光吸收值），L为比色杯的内径（cm） §5 核酸的分离纯化、测定及研究方法 §5 核酸的分离纯化、测定及研究方法 2、定糖法 RNA的测定：RNA分子中所含的核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成绿色化合物，该化合物可在670-680nm波长下进行比色测定。 DNA的测定：DNA分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰色化合物，该化合物可在595-620nm波长下进行比色测定。 §5 核酸的分离纯化、测定及研究方法 * * 生物化学 第二章 核酸的化学 核酸的性质与 研究方法 §4 核酸的理化性质 §5 核酸的分离纯化、测定 及研究方法 第二章 核酸的化学 核酸的性质是由其结构决定的。核酸的结构特点是分子大,有一些可解离的基团,具有共轭双键等.这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性质的基础.下面介绍几种重要的性质: §2.6 核酸的理化性质 一、物理性质 1、性状： RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色粉末或结晶； DNA则为疏松石棉一样的纤维状固体。 2、粘性：核酸的水溶液粘度