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酿酒酵母单倍体的分离
酿酒酵母单倍体的分离
1. 酵母在YPD培养基上经二级活化后离心 6000rpm, 10min ，用无菌水 生理盐水 洗涤三次后，取酵母泥于麦氏培养基上划线，28℃培养。（麦氏培养基，为生孢子的培养基）
2. 每天镜检酵母，观察酵母产孢情况。
3. 产孢率较高时（5-7d左右），挑取菌落于1mL 2.5%的蜗牛酶溶液中，置45℃水浴1h。（蜗牛酶，用于脱去单倍体孢子的子囊壁）
4. 将菌液倒入装有9mL生理盐水和数粒玻璃珠的三角瓶中，于58℃水浴20min（高温杀死营养细胞），加入2mL灭菌的石蜡后，37℃、200rpm摇床培养1h。
5. 取菌液经适当稀释后，涂布YEPD培养基平板，30℃培养2-4d后挑取较小菌落，PCR鉴定单倍体菌株。
注：（1）酵母接种于YPD培养基上（一级活化）后，于28℃恒温培养箱中，培养36h，期间需摇晃几次。然后进行二级活化。
酵母子囊孢子的形成及观察
1 试剂
6%孔雀绿；0.5%蕃红染液；
2 操作步骤
载玻片上滴一滴蒸馏水，挑取菌落于载玻片水液，涂匀，酒精灯火焰上热固定。
加数滴孔雀绿于涂片处，染色1min后水洗，然后滴加95%乙醇维持30s。
倾去乙醇，用蕃红溶液复染30s，再倾去染色液，用吸水纸吸干，于显微镜下观察。
菌体红色，子囊孢子呈绿色。
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