全式金PCR讲座.ppt

NH4+和K+阳离子存在于PCR缓冲液中，加强了引物的特异性退火。 PCR体系 模板，引物 dNTPs 酶 反应缓冲液(pH值，离子强度， Mg2+) SuperMix （简易、操作污染几率小） Mg2+ dNTPs PPi PCR酶 模板链 合成链 PCR体系中各组分相互作用 模板：品质高 模板核酸的纯度，也是PCR成败的关键环节之一。这些杂质经常存 在于传统方法制备获得的模板中，详情见下表： 0.005%(w/v) SDS ≥15 %(v/v) RT反应混合物 ≥0.5mM EDTA ≥5mM 氯化钠 1 %(v/v) 乙醇 0.2 %(v/v) 酚 抑制PCR反应的杂质浓度 杂质 高保真要求：降低循环数，增加模板量 定点突变：减少模板量，提高突变率 模板量加入过多，也会产生弥散的产物或者非特异性的扩增产物 模板中抑制物或杂质较多：降低模板用量或稀释模板（植物基因组、土壤提取物、粪便提取物、血样等） 模板：浓度适当 作为原料，对反应有至关重要的影响 影响产量 影响特异性 影响保真性 选择可靠的dNTPs：浓度准确，高纯度 dNTPs：浓度与纯度 不同公司dNTPs的比较 2~5泳道为不同公司dNTPs扩增效果比较 上下两图为两个公司dNTPs扩增效果的比较 图A 图B 图C pH值 提供酶的最佳工作环境 pH升高，扩增量提升，但突变率也会有所上升 pH降低，扩增量下降，保真性提升 离子强度（KCl , (NH4)2SO4等） 中和DNA所带电荷 反应缓冲液 Mg2+ 酶工作所必需的离子 与dNTPS和模板螯合在一起，成为DNA聚合酶识别的底物 Mg2+升高：提升扩增量，产生非特异性扩增，突变几率增加 Mg2+降低：降低扩增量，特异性增强，突变少 可以根据实验要求对进行镁离子进行调整 对于Pfu 系列酶，有时需要适当调整（如cDNA模板，长片段） 关键组分：Mg2+ M 1 2 3 4 人基因组DNA模板, Rhod 1.2 kb EasyTaq 扩增 Lane M：Trans 8K DNA Marker Lane 1：Mg2+ 1.0 mM Lane 2：Mg2+ 1.5 mM Lane 3：Mg2+ 2.0 mM Lane 4：Mg2+ 2.5 mM 随着Mg2+浓度的提高，扩增产量随之提升 人cDNA模板, GAPDH 0.5 kb EasyTaq 扩增 Lane M：Trans 2K DNA Marker Lane 1：Mg2+ 0 mM Lane 2：Mg2+ 1.0mM Lane 3：Mg2+ 2.0 mM Lane 4：Mg2+ 3.0 mM Lane 5：Mg2+ 4.0 mM M 1 2 3 4 5 随着Mg2+浓度的提高，产物特异性逐渐降低 即使是同一种酶，对于不同的反应，需要的最佳工作环境也有所不同——缓冲液的偏好性 TransTaq HiFi：配有两种缓冲液，针对不同类型模板 Buffer I：基因组模板 Buffer II：cDNA模板、质粒模板 缓冲液的偏好性 某些酶配套有GC Buffer，针对高GC含量或复杂模板 DMSO、甜菜碱、海藻糖……等增强剂 辅助解链，稳定单链结构，促进合成 复合增强剂：几种增强剂按特定比例的混合物，与单一增强剂相比，有更强的促进能力、更广泛的适用性 GC Enhancer，PCR Stimulate（TransGen），作为单一组分可以与缓冲液兼容，灵活调整浓度。 1：Mg2+ 2mM，1×GC Enhancer 2：Mg2+ 3mM，1×GC Enhancer 3：Mg2+ 3mM，2×GC Enhancer 增强剂与Mg2+对PCR的影响 模板 GC 含量80% 目的条带 TransTaq HiFi TransStart Taq 1 2 3 1 2 3 PCR条件（三步法） 预变性 变性 退火 延伸 后延伸 循环数 预变性 变性 退火 延伸 后延伸 94℃ 94℃ __ ℃ 72 ℃ 72 ℃ 5-10 min 30 s 30 s s 10-20 min PCR条件（两步法） 预变性 变性 退火延伸 后延伸 循环数 预变性 变性 退火延伸 后延伸 94℃ 94℃ 68 ℃ 68 ℃ 5-10min 30s s 10-20min 两步法的适用范围 对于短片段的扩增，减少变温步骤可节省反应时间。 对于长片段的扩增，减少变温步骤可减缓长时间反应中酶活的衰减 并不适合所有的反应 关键在于退火与延伸温度能否合一？ 取决于酶的活性特点、引物的退火温度等 均可以用三步法替代 关键：退火温度 过高：退火失败，扩增量低或无扩增 过低：非特异性退