第五章第三节一二沉淀与离心部分.ppt

（3）等密度离心 分离密度不同的颗粒，在离心力作用下上浮或下沉。 常用介质：铯盐。如CsCl、Cs2SO4等 操作方法： 混匀样品与介质 离心 分离 4、离心机操作注意事项 必须事先在天平上精密的平衡离心管和其内容物。 依据不同离心液体选择不同离心管，每次检查转头 低于室温离心时，要先将转头预冷 离心过程中不得随意离开 了解转头最高离心转速和使用积累限时。 第三节 酶的分离方法 一、沉淀分离 二、离心分离 三、过滤与膜分离 四、层析分离 五、电泳分离 六、萃取分离 沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 原理：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。 不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关。 一、沉淀分离 沉淀分离方法 适用分子 盐析沉淀法 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化 等电点沉淀法 用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，单独应用较少，常与其它方法结合使用 有机溶剂沉淀法 多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化 复合沉淀法 发展较快的新方法 选择性变性沉淀法 多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白 常用的几种沉淀分离方法 1、盐析沉淀法 在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 优点： 成本低，不需要特别昂贵的设备 操作简单、安全 对许多生物活性物质具有稳定作用 （1）基本原理 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。 （2）中性盐的选择 溶解度大：硫酸铵在0℃时仍 有70.6%（质量分数）的溶解度，远远高于其它盐类。 盐类 0 ℃ 20 ℃ 80 ℃ 100 ℃ 硫酸铵 70.6 75.4 95.3 103 硫酸钠 4.9 18.9 43.3 42.2 硫酸二氢钠 1.6 7.8 93.8 101 几种盐在不同温度下的溶解度（g/100ml水） 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可能除去75%的杂蛋白，纯度提高了4倍。 不易引起变性，有稳定酶的作用：有些酶用2-3mol/L的硫酸铵保存可达数年之久。 价格便宜，废液不污染环境 （3）盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。 研磨硫酸铵成细粉 边搅拌边缓慢均匀少量多次加入 冰浴 离心 过滤 加盐速度尽量慢，避免局部硫酸铵浓度过大而造成蛋白质变性 低浓度 高浓度 （4）盐析的影响因素 蛋白质浓度：2.5%-3.0%（质量分数）较适中，相当于25-30 mg/ml pH值：常选在该酶的等电点附近 温度：对温度敏感的酶，要求在0-4℃下操作，以避免活力丧失 盐析时注意事项： 酶不同，结构不同，所需盐浓度不同。另外，酶的来源，杂质等也对其有影响。 盐析后的酶含大量盐分，要进行脱盐处理 2、有机溶剂沉淀法 原理：降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 优点： 分辩能力比盐析高 沉淀不用脱盐 缺点： 对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。 （1）有机溶剂的选择和浓度计算 原则：能与水互溶 常用试剂：乙醇、甲醇和丙酮（糖、核酸等常用的是乙醇） 计算公式： V=V0(S2-S1)/(100-S2) 需要加入量 原溶液体积 原溶液中有机溶剂的体积 有机溶剂终体积 加入有机溶剂的体积分数（纯溶液体积分数为100%） （2）有机溶剂沉淀的影响因素 温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。 注意！大多数酶在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性！！！ 样品浓度：通常使用5-20mg/ml的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的分离效果。 pH值：选在等电点附件，提高分辩能力 离子强度：不超过5%为宜。乙醇溶液不超过原溶液2倍体积为宜。 离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同分子大小、密度的物质分离的技术。 二、离心分离 1、基本原理 F=mω2r 当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。 2、相对离心力 RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=F离心力/F重力=mω2r/mg=ω2r/g  g为重力加速度（980.7cm/sec2) RCF= 1.119×10-5× (r/min)2 ×r 3、离心机的主要构造和类型 （1）制备性离心机分为三类： A、普通离心机 最大转速6000r/min左右，最大相对离