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还原糖含量测定条件探究 生命科学学院2015/5/5还原糖含量测定条件探究【摘要】比较了两种 DNS 试剂测定还原糖含量的影响因素。探讨了试剂添加量、显色时间、测定波长以及显色后存放时间对测量结果的影响。结果表明，DNS 试剂的用量1.5ml，沸水浴显色时间5min，显色定容30min 后，分别在540nm 波长条件下测定，数据的准确性和稳定性较好。【关键字】DNS（3,5-二硝基水杨酸） 还原糖 比色法 测量条件目前，测定还原糖含量的方法很多，3,3-二硝基水杨酸（DNS）比色法是还原糖含量测定的一种常用方法。其具有简便、快速、灵敏度高等特点，但不同资料介绍的条件有很多差异，影响了测定结果的准确性和可比性[1-5]。本文对DNS比色法测定条件进行探究，讨论影响测量的关键因素，使测量结果更具有准确性和可比性，为实际采用该方法提供参考。1 材料与方法1.1材料与试剂3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、苯酚、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、醋酸钠、冰乙酸，以上药品为分析纯。1.2实验仪器SP-721E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；Acculab精密电子天平；702-型电热鼓风箱 大连干燥箱厂；DZF-6050型真空干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；THZ-82A水浴恒温振荡器 江苏荣华仪器制造有限公司；80-2离心机 上海浦东物理光学仪器厂；HH-4 数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。1.3实验方法1.3.1 DNS 试剂配制称取3.25g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入500ml容量瓶，加2mol/L氢氧化钠溶液162.5ml，再加入22.5g 丙三醇，摇匀，定容至500ml，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用[3]。称取2.5g 3, 5一二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0. 5g苯酚，再溶解0.075g亚硫酸钠、2. 5g氢氧化钠和50g酒石酸钾钠，移入500m1容量瓶，摇匀，定容至500m1，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。储存七天后使用[4]。1.3.2葡萄糖标准溶液的配置称取大于1g的葡萄糖置于热风干燥箱98℃干燥至恒重，准确称取 1.000g 葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。分别按表 1 进行配置操作，充分混匀后于沸水浴中加热煮沸 5min。流水冲冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水4ml，混匀。以管 1 为空白对照，540nm 波长下测各管的吸光度。绘制吸光度 - 葡萄糖浓度曲线。表1 葡萄糖标准溶液配置 管号 1 2 3 4 5 61mg/ml葡萄糖溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 DNS试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.01.3.3 DNS测定波长的确定取1.0ml葡萄糖标准液及1.0ml蒸馏水分别置于10ml试管中，再各加 1.5ml DNS 试剂，沸水浴加热 5min，流水冷却，蒸馏水定容。将葡萄糖显色液 - 水(空白)、DNS 试剂 - 水(空白)、葡萄糖显色液 -DNS 试剂(空白)分别在波长450～600nm 范围内进行扫描。1.3.4 DNS 试剂用量及放置时间的确定在准确加入 1.0ml葡萄糖标准溶液的系列 10ml试管中，分别加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml 的DNS试剂，沸水浴加热 5 m i n ，流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，波长540nm 下测定不同时间的吸光度。1.3.5加热时间的确定取葡萄糖标准液1ml及蒸馏水1ml于系列10ml试管中，分别加入 D N S 试剂，置沸水浴中加热、反应 1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 m i n取出，流水冷却，定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，在波长540nm 下测不同加热时间时溶液的吸光度。1.3.6精密度实验取5支管分别加入 0.5ml 葡萄糖标准溶液和 1.5ml DNS 试剂，混匀并作空白，沸水浴加热 5min，流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，波长 540nm 下测定吸光度。2结果与分析2.1绘制吸光度 - 葡萄糖浓度曲线。结果如图1所示：图1、540nm波长下葡萄糖的标准曲线2.2 DNS测定波长的确定DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。关于DNS测量还原糖含量的波长，不同文献有不同的记载：