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纤维素酶稳定性的研究 一． 背景介绍 纤维素是地球上最丰富、最廉价的再生资源。有资料表明 ,全世界每年的植物体生成量达1500亿吨干物质 ,其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨。纤维素的基本单位是葡萄糖 ,但由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造 ,其外围又被木质素包围着 ,要把它水解成可利用的葡萄糖非常困难。所以到目前为止仍没有得到很好地利用。当前 ,新能源、新食品资源的开发利用是世界各国都在研究的重大课题 ,因此 ,纤维素酶的研究成为其主要组成部分。 纤维素是一种多糖, 是葡萄糖以β- 1,4-糖苷键结合的聚合物, 在自然界中储量极其丰富, 在纤维素酶的催化条件下可分解产生二糖或葡萄糖, 纤维素的利用目前尚未完全开发, 造成资源及能源的巨大浪费。为了更好地利用纤维素, 愈来愈多的国内外学者开始关注纤维素酶的研究与应用, 期望能借助纤维素酶将地球上最丰富(占全球总生物量 80%)、最廉价的可再生资源纤维素转化为能直接利用的能源和资源。现在纤维素酶的应用已扩展到食品发酵、 医药、纺织、日用化工、造纸、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域, 其应用前景十分广阔。[1] 1.　纤维素酶的组成 纤维素酶是指 3种起协同作用的一组酶的总称 ,现已确定纤维素酶主要组分如下: 内切型葡聚糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶、纤维二糖酶。[2] 2. 纤维素酶的特性 2.1 内切型葡聚糖苷酶 也称 Cx酶、CMC酶。它以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割 ,对末端键的敏感性比间键小。其主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖等带非还原性末端的小分子纤维素。[2] 2.2 外切型葡萄糖苷酶 又叫纤维二糖水解酶或微晶纤维素酶。该酶在天然纤维素的降解过程中起主导作用 ,它能从纤维素链的还原或非还原性末端切割糖苷键 ,生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。[2] 2.3　纤维二糖酶 也称β2 葡萄糖苷酶 ,简称 BG。它能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。内切酶首先切割纤维素链使暴露出末端 ,然后外切酶连续切割纤维二糖单位 ,而β2 葡萄糖苷酶通过水解纤维二糖或纤维糊精完成协同反应全过程。[2] 3 纤维素酶的作用机理 研究人员对纤维素酶使纤维素转化为葡萄糖的过程提出了不同看法。1950 年 Reese 对纤维素酶的作用方式提出了著名的 C1- Cx假说, 并得到大多数人的支持。C1-Cx理论要点是 C1酶首先作用于结晶纤维素, 使其改变成可被 Cx酶作用的形式, Cx酶随机水解非结晶纤维素, 即可溶性纤维衍生物和葡萄糖的 β - 1, 4- 寡聚糖, β - 葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖 ( 如图所示)。 上述的 C1和 Cx分阶段水解纤维素的理论在以后的实验中没得到证实。若先用 C1酶作用结晶纤维素, 然后将 Cx酶与底物分开再加入 Cx酶, 如此顺序作用并不能将结晶纤维素水解, 只有当 C1、 Cx以及 β - 葡萄糖苷酶同时存在才能水解天然纤维素。 对于纤维素酶的作用机理,目前尚不十分明了, 有待进一步研究。[1][2] 4 纤维素酶的热稳定性的研究 4.1 酶热失活中的动力学与热力学 酶的动力学研究中一般只考虑初始反应速率及可逆反应，但在酶的应用及工艺设计时，酶的失活速率就显得十分重要，特别是在连续流动的酶反应过程中，过程的经济可行性往往取决于酶的使用寿命。在失活动力学研究中，对于温度和失活速率常数之间的关系，可以用Arrhenius关系式： （1-2） 许多酶的失活反应在一定温度范围内都服从Arrhenius关系。因此，在lnk～1/T图上可以获得频率因子k0和失活活化能Ea。但应该强调的是，对酶失活反应而言， 往往只在很小的温度范围内满足Arrhenius关系。基于酶的蛋白质本性，许多酶在45～50℃就会部分变性，在55℃时变性已经很严重了，会造成蛋白质球形结构的破坏，使酶活性迅速下降。因此，在研究较宽范围内酶的失活动力学时，不能简单的依靠Arrhenius关系式。 酶的热失活可能是可逆的、不可逆的或介于两者之间，根据平衡模型，在失活的初始阶段，存在一个简单的可逆过程，可以描述广泛温度范围内的酶失活动力学和活性的关系。 在天然条件下，蛋白质折叠可以是自发进行的，根据热力学原理，蛋白质折叠是自由能减少过程，即折叠过程的自由能变化为负值。在高温和低温条件下，失活的自由能都可能为正值，此时去折叠过程是自发的。热力学参数是判断失活过程能否发生的基本物理参数。[1][2] 热引起酶失活首先使蛋白质分子构象改变而伸展，随时丧失生物活性。该变形过程可用下述方法测定，圆二色性、光旋度、差失扫描量热法、随加热测量