综合实验超氧化物歧化酶的分离与纯化要点.docVIP

综合实验 超氧化物歧化酶的分离与纯化 实验背景 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是广泛存在于生物体内的金属类酶。它能与体内的谷胱甘肽过氧化物酶，过氧化氢酶共同作用，将自由基转化为水和氧分子，是生物体内重要的自由基清除剂。SOD催化如下反应： O2 + O2 -. + 2H+ →H2O2 + O2 根据金属辅基成分的不同，SOD可分成3种类型：铜锌超氧化物歧化酶(Cu· Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD），其中，Cu·Zn-SOD为最常见的一种超氧化物歧化酶，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，Cu·Zn-SOD酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。Mn-SOD主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。Fe-SOD主要存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在，纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。 【实验预习思考题】 1、认真阅读实验指导书，绘制本实验中超氧化物歧化酶的提取分离流程图。 2、DEAE-32离子交换纤维素分离超氧化物歧化酶的原理是什么？ 实验一 超氧化物歧化酶的活性测定 【实验原理】 SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2-，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法、细胞色素C法、肾上腺素自氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚自氧化法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性。酶活性单位定义为：25℃恒温条件下，1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个酶活力单位。 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -.，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色（醌类物质），几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -.与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。 【实验材料】 1、试剂 （1）pH8.0，50mmol/L的PBS 母液1：称取9.465g Na2HPO4定容至1000ml（可等比定容至500ml）。 母液2：称取9.07g KH2PO4定容至1000ml（可等比定容到250ml，此母液需求量远小于上一个母液）。 取487.5ml母液1和12.5ml母液2混合即为50mmol/L的PBS。 （2）10mmol/L HCl （3）6mmol/L邻苯三酚 称取邻苯三酚0.0756g，用10mmol/L盐酸定容至100ml，避光保存。 （4）10mmol/L EDTANa2：取EDTA Na2 0.372g定容至100ml。 （5）SOD样液，从0.02到0.05mg/ml样酶中选取5~6个浓度。 2、器材 恒温水浴槽；紫外分光光度计；试管、刻度吸管、微量注射器 【实验方法】 1、邻苯三酚自氧化速率测定 所用试剂应提前在25℃水浴（若室温接近或高于25℃，室温即可）保温20min。严格按照表一自养化管所列顺序向试管中加入各组分，当加入邻苯三酚后迅速摇匀，立即倾入比色杯中，用10mmol/L HCl 作空白，在325nm波长处每隔30s测定吸光值（A）一次，整个操作在4min内完成，要求自氧化速率控制在0.070A/min左右（可增减邻苯三酚的加入量，使速率达到0.070A/min左右）。计算出每分钟A的增值，此即为邻苯三酚自氧化率（A0）。 自氧化速率=（第5min OD值-第1min OD值）/4 × 100% 表1 邻苯三酚自氧化速率测定SOD酶活试剂用量表 试剂 自氧化管(mL) 酶活管(mL) 终浓度（mmol/L） pH8.0，50mmol/L的PBS 4.5 4.5 22.5 蒸馏水 4.2 4.2 — 10mmol/L EDTA溶液 1.0 1.0 1.0 SOD样液 — 0.02 6mmol/L邻苯三