第五章酶分子修饰和改造要点分析.ppt

第五章　酶的分子修饰和改造 第一节 酶化学修饰的原理和方法 一、酶的化学修饰原因 1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。 2．作用的最适条件不符。 3．酶的主要动力学性质的不适应。 4．临床应用的特殊要求。 酶化学修饰的应用 理论研究 酶中特定基团之间的距离 氨基酸残基的存在状态 氨基酸测序 确定酶活性部位 氨基酸数量测定 医药 解除医用酶免疫源性和抗原性 提高医用酶稳定性 延长医用酶体内半衰期 生物技术领域 改变酶最适pH 改变酶底物专一性 有机溶剂可溶解酶 提高酶耐热、酸、碱、有机溶剂能力 二、酶修饰的方向 1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA 或mRNA 进行改造或修饰 2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的一级结构进行改造 氨基酸的置换 肽链有限切除 氨基酸残基的修饰等 三、酶化学修饰的基本原理 1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性 酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，从而增强酶的热稳定性。 2．保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电斥力能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑制剂能力增强。 三、酶化学修饰的基本原理 3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭受蛋白水解酶攻击破坏的可能性。 4. 消除酶的抗原性 有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了酶分子上抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低乃至消除。 能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。 四、对修饰剂的了解 1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度、对蛋白质的吸附性 2．修饰剂上反应基团的数目及位置 3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件 五、酶性质的了解 1．酶活性部位情况 2．酶的稳定条件、酶反应最适条件 3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等 六、反应条件的选择 1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例 2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH 条件 3．反应温度及时间 七、酶修饰方法 1．酶分子侧链基团的化学修饰 2．有机大分子对酶的化学修饰 3．蛋白质类及其他 第二节 酶分子侧链基团的化学修饰 一、几种重要的修饰反应 1.酰化及其相关反应 修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、O-甲基异脲等。 修饰残基：氨基、羟基、酚基、巯基等。 2．烷基化反应 修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰卤代物等。 修饰残基：氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基等。 3．氧化和还原反应 修饰剂：氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原剂（2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等） 修饰残基：巯基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二硫键（还原）。 4．芳香环取代反应 修饰剂：四硝基甲烷 修饰残基：Tyr，Phe。 二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1．巯基的化学修饰 巯基是许多酶活性中心的催化基团 形成二硫键稳定酶的结构 最容易反应的侧键基团之一 通过修饰可提高酶的稳定性 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺；常用N-乙基马来酰亚胺、5,5′-二硫-2-硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ）。 DTNB（Ellman试剂）用于定量酶分子中巯基数目。 2．氨基的化学修饰 Lys的氨基是酶分子中活性很高的基团，容易被修饰。 常用氨基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）、碘代乙酸、还原烷基、。 ２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于测定酶蛋白中Lys数量。 常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)、丹磺酰氯(DNS)修饰多肽链N末端，用于N末端的测定。 3. 羧基的化学修饰 主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。 产物一般为含酯类或酰胺类的修饰酶。 水溶性的碳二亚胺为最常用的修饰剂，可定量测定羧基含量。 ．咪唑基的化学修饰：焦碳酸二乙酯。 ．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2