Western blot 操作过程.docVIP

Western blot 操作过程1.SDS试剂的配制（1） 30%丙烯酰胺溶液: 称取29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml去离子水中温热,使之充分溶解,放置于棕色瓶中保存；（2）10%SDS溶液 称取SDS10g, 加入100ml蒸馏水,微热溶解；（3）10%过硫酸铵 称取0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水,临用前配制；（4）三羟甲基氨基甲烷(Tris)-甘氨酸电泳缓冲液(PH8.3) 去离子水 ? ? ? 900mlTris碱 ? ? ? ? 3.02g甘氨酸 ? ? ? ? 18.8g10%SDS ? ? ? ? ? 10ml用去离子水补至 ? 100ml（5）浓缩胶（upper gel）缓冲液(0.05mol/L PH6.8 Tris-HCl缓冲液): 称取6.0gTris,加入50ml蒸馏水,使之溶解,用1mol/L的HCl调至PH6.8,再加蒸馏水至总体积100ml;（6）分离胶（low gel）缓冲液(1.5mol/LPH8.8Tris-HCl缓冲液): 称取Tris2.5g先用少量蒸馏水溶解,加入1mol/L的HCl约25ml,再加1mol/LHCl调至PH8.8,最后加水补至100ml。2. 凝胶的灌制及电泳（1）制备浓度为12%的分离胶5ml去离子水 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1.6ml30%丙烯酰胺溶液 ? ? ? ? ? ? ? ? 2.0ml1.5mol/LPH8.8Tris-HCl缓冲液 ? 1.3ml10%SDS ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.05ml10%过硫酸铵 ? ? ? ? ? ? ? 0.05mlTEMED ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2μl(2)速在两玻璃板间灌注丙烯酰胺溶液,预留1.5cm灌注浓缩胶, 应排除凝胶底部玻璃 ? 板间的气泡.用吸管在丙烯酰胺溶液上层轻轻覆盖双蒸水, 将凝胶置于室温；(3)分离胶聚合后倾出覆盖液体,并用滤纸吸净残留液体；(4)制备浓度为5%的浓缩胶2ml；去离子水 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1.4ml30%丙烯酰胺溶液 ? ? ? ? ? 0.33ml1．0mol/L PH6.8 Tris-HCl缓冲液 ? 0.25ml10%SDS ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 20μl10%过硫酸铵 ? ? ? ? ? ? ? ? 20μlTEMED ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2μl(5) 在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶, 立即插入梳子,避免气泡产生；(6) 当浓缩胶聚合的同时,将组织裂解蛋白抽提液和等量的加样缓冲液在沸水中加热5分钟,使蛋白变性；(7) 浓缩胶聚合后小心拔出梳子,立即用去离子水洗涤加样槽,以除去未聚合的丙烯酰胺；(8) 电泳槽中加满电泳缓冲液,用微量加样器向加样槽中加入样品和低分子量蛋白质标准(Markers)；(9) 电泳装置与电源相连,凝胶上所加电压50V,当染料前沿进入分离胶后,把电压提至100V,继续电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部,关闭电源；3.转移（1）.电泳结束前,戴上手套,裁6张滤纸和一张硝酸纤维素膜,大小应与凝胶大小吻合；（2）.在一个托盘中加入少量转移缓冲液,将6张滤纸、海绵及硝酸纤维素膜浸于其中；（3）.转移缓冲液的配制：: 甘氨酸 ? ? ? 2.9g Tris碱 ? ? ? 5.8g SDS ? ? ? ? ? 0.37g甲醇 ? ? ? ? 200ml加双蒸水至总量为1L（4）. 戴上手套按以下方法安装转移装置：A．在塑料夹上放置用转移缓冲液浸泡过的海绵及3张滤纸,逐张叠放,精确对齐,然后用一玻璃移液管做滚筒以挤出气泡；B．把硝酸纤维素膜放在滤纸上,精确对齐,滤纸与膜间不能留有气泡；C．从电泳槽上撤下放置SDS凝胶的玻璃,把凝胶转移至去离子水中漂洗一下,然 ? ? ? 后平放于硝酸纤维素膜上并对齐,排除所有气泡；D． ? ? 最后3张滤纸放在凝胶上方,各层精确对齐并排除气泡；（5）.将夹层物中滤膜面正对阳极,接通电源,电转移350mA，1小时左右；（6）.断开电源并拔下电泳槽上的插头,拆卸转移装置,逐一揭去各层.把凝胶转移至盛有考马斯亮蓝的平皿中按前述方法进行染色,以便检查蛋白质是否转移完全；（7）.把滤膜转移至含有丽春红染液的平皿中染色10分钟左右,轻轻摇动染液使之充分接触.；? ? 丽春红染液的配制:： 丽春红 ? ? ? ? ? ? ? 2g三氯乙酸 ? ? ? ? ? ? 30g磺基水杨酸 ? ? ? ? ? 30g溶于100ml水。使用时取一份上述贮存液加9份去离子水即可。? ? 蛋白