DNA测序技术及展望要点.pptxVIP

杨倩倩 生命科学学院 Tel:Email: yqq@cjlu.edu.cn DNA测序技术 第一代测序技术 第二代测序技术 第三代测序技术 DNA测序技术的展望 第一代测序技术 DNA测序即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 DNA序列测定的意义 生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之中 …GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT… 第一代DNA测序技术： 传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术。 1963年，Sanger等人第一次完成胰岛素51个氨基酸序列测定 70年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了Sanger双脱氧链终止法和Maxam----Gilbert化学裂解法 第一代DNA测序技术包括：化学降解法、双脱氧链终止法、荧光自动测序技术和杂交测序技术。 1.1 化学降解法 基本原理: 利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。 将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射 性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差 一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳，读取DNA的核苷酸顺序 技术路线 碱基 特异修饰方法 G Ph8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 A+G pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键 C+T 肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去 C 1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶 Maxam-Gilbert 法所用的化学技术 化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。 优点：即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。 缺点：操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。 1.2 双脱氧链终止法 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F. Sanger等人于1977年发明的。 F. Sanger （1980年诺贝尔奖获得者） dideoxy chain-termination method “双脱氧末端终止”的含义 PCR（聚合酶链式反应）原理 反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90℃）、退火（54 ℃）、延伸（72 ℃） 双脱氧链终止法基本原理： DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP，ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端，终止DNA链的增长。 合成的互补链在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，读取待测DNA的顺序。 Sanger 双脱氧末端终止法测序原理 dNTP 反应混合物 Klenow酶 未知序列的单链DNA CTGACTTCGACAAAGAA 5′ 3′ Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动化测序基本原理： 与链终止法测序原理相同 用不同荧光色彩标记ddNTP ddATP标记红色荧光 ddTTP标记绿色荧光 ddCTP标记蓝色荧光 ddGTP标记黄色荧光 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,简化为由1个泳道同时判读4种碱基 目前所用自动测序技术的改进同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳 多色荧光标记 毛细管电泳 单色荧光标记 平板电泳 同位素标记 平板电泳 A C G T 测序图谱 T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T DNA测序仪示意图 computer analysis 凝胶中DNA移动方向 样品槽 激光器 输入光学系统 成象透镜 聚焦透镜 高灵敏度相机 旋光镜/棱镜组件 DNA自动测序结果举例 目前商品化生产的最先进测序仪为ABI3730测序