SDS-PAGE要点.pptx

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、SDS原理 SDS电泳技术最初于1967年由Shapiro建立，该技术仅根据亚基分子量的不同就可以把不同蛋白质区分开，用于蛋白质的分离纯化。 SDS技术在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂SDS（十二烷基磺酸钠），使蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、SDS 一种阴离子去污剂、强还原剂 含有大量带负电荷的SO32- 能够破坏蛋白质分子之间的非共价键 破坏蛋白质分子的二级、三级结构 解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、蛋白质-SDS复合物的特点： 形状像一个长椭圆棒。 短轴对不同的蛋白质-SDS胶束基本上是相同的。 长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，消除了蛋白质分子间原有电荷的差异。 在SDS电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 二、SDS样品检测 SDS一般采用不连续缓冲系统，由Tris/甘氨酸电极缓冲液、浓缩胶和分离胶构成，采用垂直电泳的方式对待检测样品进行分析。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 二、SDS样品检测 SDS操作步骤如下： ① 采用一定浓度的浓缩胶和分离胶对样品进行检测（视蛋白质分子量大小而定）； ② 恒定电压电泳一定时间； ③ 电泳结束后取下凝胶，至染色液中染色，过夜； ④ 用脱色液脱色至结果可见，经扫描保存。 结果分析参照蛋白质标准对照进行，或进一步进行western blotting，分析不同蛋白质分子的组成。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 Western blotting多种蛋白的检测 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、SDS常见问题 1、制胶过程中经常出现漏胶现象。 由于玻璃板或底部密封条的密封性不好导致的，需在玻璃板两侧涂抹凡士林或及时更换密封条。 2、“皱眉”形条带的产生。 一般是由两玻璃板之间的底部间隙气泡未排除干净引起的。可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 3、 “微笑”形条带的产生。 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。需待凝胶充分凝固再做后续实验。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、SDS常见问题 4、胶片中出现纹理现象。 主要是样品不溶性颗粒引起的。可采取加样前离心或者加适量样品促溶剂的方法避免。 5、溴酚蓝不能起到指示作用。 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。需要更换正确pH值的缓冲液，降低分离胶的浓度。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、SDS常见问题 4、胶片中出现纹理现象。 主要是样品不溶性颗粒引起的。可采取加样前离心或者加适量样品促溶剂的方法避免。 5、溴酚蓝不能起到指示作用。 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。需要更换正确pH值的缓冲液，降低分离胶的浓度。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、SDS的应用 1、蛋白质纯度分析 2、蛋白质分子量、浓度的测定 3、免疫印迹的第一步 4、蛋白质修饰的鉴定 5、分离放射性标记的蛋白质 6、分离和浓缩用于产生抗体的抗原 7、显示小分子多肽 谢谢，请提出宝贵意见！