DNA甲基化检测要点.ppt

DNA甲基化的检测方法 1.DNA甲基化检测的基本原理 目前文献报道的各种DNA 甲基化分析方法均依赖于三种基本原理，它们分别是： 甲基化敏感性限制性核酸内切酶（MSRE）分析方法 对DNA 中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫酸盐转化 用甲基CpG 结合蛋白分离甲基化的DNA 1.1甲基化敏感性限制性核酸内切酶分析方法 1.2对DNA 中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫酸盐转化 在DNA 单链中，未甲基化的胞嘧啶在高浓度的重亚硫酸盐作用下经一系列化学反应后可转化成尿嘧啶（U），而5mC 则保持不变。在随后的PCR 过程中，尿嘧啶（U）被转换为胸腺嘧啶（T）。如此就将胞嘧啶的甲基化修饰这种化学修饰信息转化为序列差异信息。 1.3.用甲基CpG 结合蛋白分离甲基化的DNA 利用甲基CpG 结合蛋白（MeCP）可以结合DNA中的甲基CpG的性质，以MeCP 为填充物开发的MBD 柱层析 法可将基因组范围内的甲基化DNA片段分离出来，再结合前两种原理可对全基因组范围内的甲基化位点进行扫描 2.DNA甲基化检测的方法 基于以上的每一种原理均可开发出多种方法，每种方法都有其优缺点及适用范围。常用方法有： 甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增（MS-MLPA） 甲基化特异性PCR（MSP） 重亚硫酸盐测序 2.1甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增（MS-MLPA） 这是一种基于MSRE 的分析方法，该方法要求所检测的CpG 位点位于某一特定的MSRE 识别序列内，如HhaⅠ所识别的GCGC。针对该位点设计两条探针，上游探针的3′端位于该位点5′端1 个碱基处，下游探针5′端位于该位点3′端1 个碱基处。上游探针的5′端和下游探针的3′端含有一套公用PCR 引物序列。针对不同位点的探针长度可有不同。将探针与模板DNA 杂交后，加入连接酶进行连接反应，并加入相应的MSRE 如HhaⅠ。若该位点甲基化，HhaⅠ不能切割， 则模板保持完整， 随后的PCR 反应可以进行， 若未甲基化，HhaⅠ将连接反应形成的模板DNA切割，随后的PCR 反应不能进行。 2.2甲基化特异性PCR（MSP） 基本原理是当用化学试剂重亚硫酸盐处理样品时，所有未被甲基化的胞嘧啶C将发生脱氨基作用，变为尿嘧啶U；而甲基化的胞嘧啶则不发生改变。 该技术主要对CpG岛甲基化情况进行分析。甲基化和未甲基化的样品被处理后，其碱基序列将不再相同。据此分别设计甲基化引物和非甲基化两对引物去扩增，重硫酸盐处理后的模板，以是否能得到相应的PCR产物确定甲基化情况。 若仅能用甲基化引物得到预期的PCR产物，则该片段高度甲基化；若仅能用非甲基化引物得到预期的PCR产物，则该片段未发生甲基化。若两对引物均能得到阳性PCR产物，则说明该片段部分甲基化。 2.3重亚硫酸盐测序 1.待测DNA样品用限制性内切核酸酶或超声波破碎处理打断成500-1000bp碎片 2.重亚硫酸盐处理碎片：未甲基化C脱氨基转变成U，甲基化C被保护不变 3.PCR扩增、克隆 4.设计测序引物，进行测序（U被读成T） 5.参考原始序列判断原C位点是否甲基化 2.4几种方法的比较 * * 此类方法主要是利用部分甲基化敏感性限制性核酸内切酶(MRSE) 所识别的DNA序列如果被甲基化则不能切割这一序列。 利用这一特性， 对基因组DNA 进行酶切后，再采用一些方法对酶切后基因组DNA 进行检测，即可明确所检测位点的甲基化状态 技术路线 染色体DNA的制备 染色体DNA的亚硫酸盐处理 引物的设计 PCR扩增，得到结果 技术 原理 优点 缺点 MS-MLPA 原理一 酶切对模板DNA 的影响较小，因而可用于石蜡包埋组织等类型检材DNA 甲基化状态的检测。 检测结果会受到酶切是否完全的影响，并且也只能分析RE 识别序列中的CpG 位点 MSP 原理二 避免限制性酶切的后续影响，敏感性高 需要预先知道片段序列，只能做定性研究，易受重亚硫酸盐处理不完全影响而出现假阳性。 重亚硫酸盐测序 原理二 精度高，能确定片段中每一个CpG岛的甲基化状态 过程繁琐，成本高 *