大连理工大学生化实验B要点.docx

2014年生物化学实验B 实验报告 姓 名： 姓名 学 号： 201247044 实验时间： 2014.11.15 实验分组： 第七组 组内成员： 组员 201247002 组员 201247020 组员 201247060 任课教师： 李晓晖 小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量 组员1，组员2，组员3，组员4 化工与环境生命学部 化工学院 化学工程与工艺（国际）1201班 摘要 本文以从小牛肠中提取碱性磷酸酶为例，介绍了生物体中分离、提取酶的方法，以及如何使用考马斯亮蓝法测定所提取酶的蛋白含量并以此得出酶活。同时通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定给定蛋白质样品的相对分子质量。 关键词 小牛肠碱性磷酸酶 酶活 对硝基苯酚 吸光值 考马斯亮蓝R-250 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量 碱性磷酸酶（AKP,EC 3.1.3.1）是一种非特异性水解酶，广泛存在于动物各脏器、微生物和植物中。它在体外能催化多种磷酸单脂类化合物的水解，得到相应的醇。不同来源的AKP，其分子量和亚基结构各不相同。 小牛肠碱性磷酸酶相对分子质量为145000，等电点为7.5。在体外可催化底物对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，后者在405nm光波长下有最大吸收，通过测定吸光值的变化率，即可测定碱性磷酸酶的活力。 酶活定义：在最适条件下，以每分钟催化水解1μmol底物的酶量为一个酶活力单位。本实验温度取37℃。 酶活力的计算： 酶活力（u/mg）= 式中，A/min为405nm波长下的吸光值的变化率；VR为反应液的体积，D为稀释倍数；E405为405nm波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数，18.3；VE为所加酶液体积；C为蛋白浓度；L为比色皿光程。 考马斯亮蓝R-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝R-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为465nm，后者为595nm。在一定蛋白浓度范围内（0.01-1.0mg/L），蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、分析蛋白质的常用方法，在科研工作中，经常需要从凝胶中回收蛋白质，用于蛋白质的测序和制备抗体[1]。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷、大小、性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。但如果加入足够量十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇，SDS就可以使蛋白质分子中的二硫键还原，蛋白质-SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于相对分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的相对分子质量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括浓缩胶和分离胶两部分。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的浓缩胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分离。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变形和解聚，解离成亚甲基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子质量。 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 （1）试剂 ① 正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存）。 ② 1mol/L乙酸（CH3COOH）,1mol/L NaOH，硫酸铵，对硝基苯磷酸二钠，二乙醇胺，盐酸。 ③ 平衡缓冲液：0.01mol/L Tris-HCl，pH8.0，含1.0×10-3mol/L MgCl2和1.0×10-5mol/L ZnCl2。 ④ 底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液(pH9.8)，含1.0×10-3mol/L MgCl2。 ⑤ 酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。 ⑥ 考马斯亮蓝G-250溶液。 ⑦ 30%丙烯酰胺。 ⑧ 分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，已加入10% S