蛋白质的分离与纯化要点.pptVIP

College of Life Science 1 蛋白质的酸碱性质 2 蛋白质分子的大小与形状 3 蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀 4 蛋白质分离纯化的一般原则 5* 蛋白质分离纯化的方法 6 蛋白质含量的测定与纯度鉴定 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。 对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。 蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。 二、蛋白质的大小与形状 π: 渗透压 R : 气体常数 T：绝对温度 c: 溶质的浓度（g/m3） π/c 对c作图，在c趋近于零时得出Mr 菲克第二定律 扩散不仅与蛋白质的分子量有关，还与分子形状有关 由于浓度差异引起的溶质分子的净迁移成为平衡迁移或者迁移。 菲克第一定律 离心机类别 低速离心机 高速离心机 超速离心机 ①离心力“ F ” 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即： a -粒子旋转的加速度， m -沉降粒子的有效质量， ω-粒子旋转的角速度， r-粒子的旋转半径( cm )。 ②相对离心力“ RCF ” 相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”（980cm/sec2）,“RCF”相对离心力可用下式计算： RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r ( rpm — revolutions per minute每分钟转数，r/min ) ③离心机转速与离心力列线计算图 一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g” 表示。 在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”. 转速与离心力的换算:先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。 超离心法类别 1#密度梯度离心法（ density gradient ） 2* 沉降速度法（sedimentation velocity） 3*沉降平衡法（sedimentation eguilibrium） 密度梯度离心法# 生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。 蔗糖密度梯度 蔗糖浓度 离心管 颗粒物质或溶质在超速离心场中的沉降速率。用小写斜体s表示。s=v/a，其中a为重力或离心加速度，v为沉降速度，即沉降系数为每单位离心力场的沉降速度。 在较低速度（8,000-20,000r/min）的离心场中，离心开始时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度。因而产生了扩散作用，扩散力的作用方向正与离心力相反，当净离心力与扩散平衡时，在离心池内从液面到池低形成一个由低到高的恒定浓度梯度。如果测得相关参数即可算出生物分子的分子量。 原理示意图 Vt ：柱床 “总容积”， Vo：即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的 水相容积 Vi：即凝胶颗粒内部所 含水相的容积。 Vg：凝胶本身的容积； Vt＝Vo十Vi十Vg 或 Vt-Vo = Vi十Vg， 凝胶床总体积 分配系数（Kd） 0＜Kd＜1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化 Ve：为实际测得的洗脱容积，自样品加入到组分最大浓度(峰)出现时所流出的容积 Ve＝Vo十KdVi Ve=K1-K2lgM K1、K2为常数，Ve可用如下表达式代替，Ve-Vo（分离体积）， Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化洗脱体积），Keff（相对洗脱体积） 在不同型号凝胶上蛋白质的选择曲线的差异 Ve与相对分子量的关系 排阻范围的选择 凝胶装柱 ①将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧； ②向柱中加入约1/3体积的0.9％NaCl溶液； ③将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液； ④凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。 ④连续而缓