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凝胶过滤层析 凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 定义 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size exclusion chromatography）、分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography） 应用 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。 原理 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱； 相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。 这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 带网孔的葡聚糖珠 小分子进入葡聚糖珠内 大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出 固定相（凝胶） 三维空间网状结构 分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。 基本概念 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分） 分配系数（Kd） Ve=Vo+KdVi (2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出 (1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里 最先流出 (3) 0 Kd 1，Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数 特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 小分子量 大分子量 典型的凝胶类型 交联葡聚糖凝胶：Sephadex?? 丙烯葡聚糖凝胶：Sephacryl ?? 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel?? 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等 凝胶过滤层析实验技术 1、凝胶的选择 2、凝胶的预处理 3、装柱 4、样品的准备 5、上样 6、洗脱和收集 7、凝胶的再生及保存 凝胶过滤层析实验技术 1、凝胶的选择 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、非特异吸附性质等。 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。 类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。 例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下列哪种凝胶最合适？ B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D） A. Sephadex G-15（分级范围， 1,500 D） C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D） 凝胶粒度的影响 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。凝胶颗粒大小要均匀，