第四章PCR技术要点.ppt

书上第5章 PCR相关技术的发展 一、RNA的聚合酶链反应RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction ) RT—PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析，还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。 RT-PCR先在反转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应，这样低丰度的mRNA被扩增放大，易于检测。RT-PCR是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法，运用此法可检测单个细胞中少于l0个拷贝的特异RNA。 RT-PCR可应用于： （1）对基因转录产物进行定性与定量的检测。 （2）对基因转录中剪切与拼接的检测。 （3）克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。 对基因转录产物进行定性与定量的检测，相对传统的检测方法，如Northern杂交、斑点杂交（ RNA dot）等而言，RT—PCR的精确度更高，且样品用量显著减少。利用RT—PCR对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。另外，还能同时分析多个差别基因的转录。如植物方面，RT—PCR常常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。 　　对基因转录中剪切与拼接的检测：如果RT—PCR引物确定了mRNA片段，根据其是否包含某个外显子，将产生两种差别DNA片段，进而在凝胶电泳图谱上显示出迁移率不同的条带。因为转座子涉及到特定的DNA序列及转座酶识别位点，用RT—PCR方法可以较精确地研究转座过程的分子机制。 反转录步骤 cDNA 链合成, 互补 mRNA链，一般利用polyT作为引物，也可用特异性的序列作为引物 G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAA Reverse transcriptase mRNA cDNA T T A G G A G TTTTTTTTTTTTTTT 逆转录polyT引物 PCR步骤 电泳分离不同大小的DNA片断 RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂质。若RNA模板中污染了微量DNA，扩增后会出现特异DNA的PCR产物，而cDNA扩增产物却很少，必要时可用无RNase的DNase处理反转录产物，消除DNA后，再进行PCR。蛋白质末除净可与RNA结合，从而影响反转录和PCR反应。 常用反转录酶有两种，即禽类成髓 细胞性白血病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）和莫洛尼鼠类白血病毒（Moloney murine leukemia virus，MoMLV）的反转录酶。 AMV反转录酶由两个不同的亚基组成，具有较强的RNaseH活性，可水解RNA模板，以RNA为模板合成单链DNA的酶活性最适作用温度为42℃。MoMLV反转录酶由一条多肽链组成，最适作用温度为37℃，RNaseH活性较低，适于合成大片段全长cDNA。但当模板RNA的二级结构影响反转录反应时，用AMV反转录酶更合适，因为较高的反应温度可消除RNA二级结构的影响。此外，这两种反转录酶的缓冲液有所不同。 近来从嗜热栖热菌HB8中分离得到的Tth耐热DNA聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，95℃时该酶的半衰期为20分钟，具有5’-3’外切酶活性，无3’-5’外切酶活性，利用Tth耐热DNA聚合酶同时具有反转录酶的特点，可简化RT-PCR，且比用Taq DNA聚合酶的反应敏感性高100倍，因此Tth聚合酶比Taq DNA聚合酶更优越。 TthDNA聚合酶作用温度高，可消除RNA的二级结构对反转录反应的影响，增加TthDNA聚合酶的反转录活性，可增加RT-PCR反应敏感性。TthDNA聚合酶的缺点是其反转录酶活性需Mn2+，而Mn2+会降低DNA聚合酶的忠实性，TthDNA聚合酶催化聚合反应的错误掺入率为1/500。 二、cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE） 尽管cDNA克隆技术发展迅速，但获得mRNA的全长转录物cDNA往往是比较困难的。尤其是获得mRNA的5’端。这是因为mRNA反转录本身的限制。mRNA的二级结构、转录条件和转录引物均影响这一过程。目前，通过预处理减少mRNA二级结构，改善反转录条件和使用特异引物延伸的cDNA等一系列措施便全长cDNA的克隆成功率增加。这种过程需要几周乃至数月才能完成。PCR技术为cDNA克隆方法开辟了新纪元。使用cDNA末端的快速扩增可在1一2