《生物制药技术教学课件》第三章 基因工程制药1.ppt

第三章 基因工程制药 概述 一、基本概念 重组DNA （in vitro DNA recombination technology ）： 基因克隆（gene cloning） 或分子克隆（molecular cloning）技术。 基因工程（gene engineering） ： 二、基因工程产生的基础 1 理论上三大发现 40年代发现了生物的遗传物质 50年代阐明了生物遗传物质的分子机制，Watson and Crick提出了DNA双螺旋结构模型。 60年代确定了遗传信息的传递方式， 2 技术上三大发明 限制性内切酶和连接酶的发现 载体（Vector）的发现：载体相当于运送重组DNA分子到宿主细胞的车子。 逆转录酶的发现，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能 一、重组DNA技术的基本过程 基因工程要素 目的基因的制备和分离 DNA重组体的构建 DNA重组体扩增和表达 重组体筛选和鉴定 外源基因的表达 表达产物的分离纯化、鉴定  二、基因工程的分类 真核基因工程 原核基因工程 三、重组DNA技术-基因工程与医学的关系 1.研究基因的结构功能和活动的规律。 2.为疾病的防治、诊断、预后及发病机理的研究开辟新途径。 3.研究细胞分化和胚胎发育的本质问题。 4.基因治疗。 5.促进基础理论的研究。 四、基因工程技术制备药物的优势 制备很珍贵但利用传统方法难以制备的药 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入研究， 可以发现和挖掘更多的内源生理活性物质。 内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白工程进行改造和克服。 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 第三节 基因工程的酶学和载体 第一部分：工具酶 限制性内切酶和甲基化酶 DNA连接酶 DNA多聚酶 第二部分：基因工程的载体 原核细胞（大肠杆菌）的常用载体： 真核细胞载体： 第一部分：工具酶 一 限制性内切酶和甲基化酶 限制性内切酶的发现 限制性内切酶的生理功能 限制性内切酶的分类和命名 识别和切割位点及切割片段的末端 Ⅱ型酶的分类 反应系统 限制性内切酶的应用 1限制性内切酶（restriction endonuclease) 定义 发现 Arber的假说 –限制修饰酶 2 限制性内切酶的生理功能 构成了细胞抵御外源入侵DNA的防御机制 提供了细菌种属间进行交叉繁殖的屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏 ， 3 限制性内切酶的分类和命名 三种类型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 命名：EcoRⅠ E: Escherichia 属 Co:coli 种 R: RY13株 Ⅰ：该菌株第一个被发现的核酸内切酶 4 Ⅱ型限制性核酸内切酶： 识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序，产生特异性的DNA片断。 1）基本特性 识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序 切割片段的末端 对dsDNA的两条链同时切割，产生3种不同的切口： 识别序列： 切割末端： 5‘GTTAAG-3’ 3‘CAATTG-5’ 5‘GTT-3’ 3‘CAA-5’ 5‘AAG-3’ 3‘-TTG-5’ 平末端 5‘CTGCAG-3’ 3‘GACGTC-5’ 5‘CTGCA-3’ 3‘-G 5‘G-3’ 3‘ACGTC-5’ 5‘-粘末端 HpaI PatI 5‘GAATCC-3’ 3‘CTTAAG-5’ 5‘-G-3’ 3‘CTTAA-5’ 5‘AATCC-3’ 3‘G-5’ EcoRI 3‘粘末端 5 Ⅱ型酶的分类 A:Isochizomers(异源同工酶)，来源不同，识别顺序相同的酶。 SmaⅠ XmaⅠ 它们识别顺序相同，切割位点不同，产生平头或粘性末端。 C C C G G G C C C G G G B: 同尾酶（isocaudarner） 5’-GATC-3’ 3’-CTAG-5’ 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ Mbo I BamH I Bgl II 来源及识别序列不相同，切割后产生相同的粘性片段 6 反应系统 组成：酶及活性缓冲液（buffer)： 影响酶活性因素： DNA的纯度 DNA甲基化程度 DNA分子结构：线性《环状 反应温度 反应系统组成 7 限制性内切酶的应用 DNA重组 组建新质粒 组建DNA物理图谱 DNA的分子杂交 制备DNA的放射性探针 DNA的序列分析 DNA甲基化碱基的识别与切割。 二、DNA连接酶 功能:是指催化两条分别具有5’-磷酰基末