放射性点标记的多肽Arg-Arg-Leu在靶向新血管的生成和肿瘤细胞分子显像中的应用要点.ppt

——孙鹏飞 放射性点标记的多肽Arg-Arg-Leu在靶向新血管的生成和肿瘤细胞分子显像中的应用 实体瘤主要由癌细胞和肿瘤血管组成，血管的新生在肿瘤细胞的代谢和转移密切相关。 临床中需要敏感的特异性强的肿瘤分子成像试剂。 Brown等发现九肽序列Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys能够与肿瘤原性内皮细胞特异性结合。 背景 目的 对靶向癌细胞和肿瘤原性内皮细胞（TDECs）的多肽显像剂tRRL进行探索。 初步研究tRRL与VEGFR-2的关系。 实验方法与结果 131I标记tRRL 体外131I-tRRL与细胞的结合实验 不同细胞对FITC-tRRL摄取 131I-tRRL体内分布实验 131I-tRRL 标记的肿瘤SPECT成像 不同细胞VEGFR-2 mRNA表达量检测 不同细胞VEGFR-2表达量检测 FITC-tRRL对肿瘤着色VEGFR-2表达与关系 FITC：异硫氰酸荧光素 SPECT:单光子发射断层成像技术 131I-tRRL合成 合成十肽（Tyr）-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys 以氯胺-T为氧化剂，用37MBq 131INa与50μg tRRL反应2min。 磷酸缓冲液稀释，葡聚糖凝胶过滤纯化。 图-1：凝胶过滤洗脱曲线 图-2： 凝胶过滤物质280nm紫外吸收曲线 tRRL标记率为60%± 5%; 纯化后131I-tRRL纯度＞95%; 比活度为1850kBq/mg 体外131I-tRRL细胞结合实验 将24孔细胞培养板上培养的HUVECs、B12、HepG2、HK-2（5×104/well）用SF-培养基饥饿培养16h。 放入含131I-tRRL的培养基中培养。 分别在0.5、1、2、4、6、24h收获细胞检测放射活性（γ-well counter）。 摄取率=摄取131I-tRRL细胞数目/总细胞数目 HUVECs：人脐静脉内皮细胞；B12：鼠黑素瘤细胞；HepG2：人肝癌细胞；HK-2：永生近曲小管上皮细胞 不同细胞对FITC-tRRL摄取 HUVECs、B12、HK-2用SF-培养基饥饿培养16h。 放入含FITC-tRRL的培养基中培养。 分别在6、24h收获细胞，用PBS重新悬浮细胞（ 2×104/ml ） 检测荧光度（Flow Cytometer）。 FITC：异硫氰酸荧光素 131I-tRRL体内分布实验 在裸鼠左前肢注入1×107 B16。 待肿瘤直径为0.8cm时，通过尾静脉注射37kBq 131I-tRRL 200μl。 24h后，脱颈椎处死，对头、肺、肝、胃、小肠、脾、骨髓、肾骨骼肌和肿瘤称重。 NaI井型检测器检测各部位放射性活度。 最终实验结果用每克部位131I-tRRL含量与总注入剂量的百分比计算 SPECT成像 在两组裸鼠左前肢分别注入1×107 B16和HepG2。 待肿瘤直径为0.8cm后，服用高氯酸钠抑制甲状腺。 通过尾静脉注射7.4MBq 131I-tRRL 200μl。 24h后，γ相机成像。 不同细胞VEGFR-2 mRNA表达量检测 Trizol提取SKOV3、HAECs、EOMAs(5×104/ml)的所有RNAs。 以GAPDH mRNA为参照，用RT-PCR检测VEGFR-2 mRNA的表达量。 SKOV3：人卵巢癌细胞；HAECs：人大动脉内皮细胞；EOMAs：鼠内皮瘤细胞 不同细胞VEGFR-2表达量检测 用RIPA裂解液提取SKOV3、 HAECs、EOMAs、THP-1、HUVECs所有蛋白质。 SDS-PAGA分离，以胞内GAPDH为参照，Western Blot 分析检测VEGFR-2表达量。 FITC-tRRL对肿瘤着色VEGFR-2表达与关系 用含FITC-tRRL的培养基培养培养HUVEC、EOMA、SKOV3。 结论 tRRL能够特异性的识别一些肿瘤细胞（如：B16，HepG2） tRRL同细胞的结合能力与细胞内VEGFR2表达量无线性关系。 tRRL在肿瘤放射性免疫治疗上有一定发展前景。 tRRL有望成为有效的肿瘤显像剂。