高通量测序技术的类型原理及应用--要点.ppt

高通量测序技术 主要内容 概 述 致 谢 概 述 高通量测序技术(High-throughput sequencing) 又称“下一代”测序技术”、深度测序 以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。 类型及原理 目前，所说的高通量测序技术主要是指454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina公司推出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的单分子测序技术。 2005年，454 Life Sciences 公司( 现已被Roche公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。 第二代测序技术 原理：酶级联化学发光反应 1.首先将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并与DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。 第二代测序技术 2.在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。 原理：酶级联化学发光反应 3.焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP 就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光，CCD 检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 第二代测序技术 此后，Illumina 公司和ABI 公司相继推出了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)测序技术。 第二代测序技术 即生成新DNA 互补链时，要么加入的dNTP 通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP 或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。 通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。 原理：与焦磷酸测序法的类似，核心思想都是边合成边测序(sequencing by synthesis)。 第二代测序技术 第二代测序技术 优点： 操作极为简便：无需进行电泳； 可以在芯片上进行高通量分析； 大大节省了成本和时间。 Illumina公司目前拥有三种测序平台，分别为HiSeq 2000、HiSeq 1000、Genome Analyzer IIx (/ )； ABI 公司则主要是SOLiD 3 和SOLiD 4 两个测序平台。 从通量这个最直观的数字看来，HiSeq 2000领先于SOLiD 4。 HiSeq 2000 测序平台单次反应可以读取200G的数据，而SOLiD 4 仅为100G 左右。 第二代测序技术 就测序读长来说，454 测序平台读长最长，目前已经达到400nt。因此，454 平台比较适合对未知基因组从头测序，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。 Solexa 测序读长较454 短，仅为100nt 左右，但测序通量高、价位低，适合基因组重测序等。 SOLiD 读长也较短，但测序精度较高，特别适合SNP 检测等。 在第二代测序平台不断完善和广泛应用的同时，以对单分子DNA进行非PCR测序为主要特征的更新的测序技术也初显端倪。 2008年4月Helico BioScience公司的Harris等在Science上报道了他们开发的基于全内反射显微镜(total Internal reflection microscopy,TIRM) 的测序技术—单分子测序技术。 单分子测序技术 基于全内反射显微镜(total Internal reflection microscopy, TIRM) 的测序技术原理： 1.将待测DNA样品随机打断成小片段，在每个小片段的末端加上poly-dA； 2.将小片段DNA模板与固定在检测芯片上的poly-dT 引物进行杂交并精确定位，并逐一加入荧光标记的末端终止子； 单分子测序技术 3.洗涤、成像，切开荧光染料和抑制基团； 4.洗涤、加帽，允许下一个核苷酸的掺入； 5.这样通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。 单分子实时技术(SMRT) 单分子测序技术 该技术利用单分子技术和DNA聚合酶，在聚合反应的同时就可以读取测序产物。 SMRT测序技术在测序速度、读长和成本方面有着巨大的优势和潜力。 Ion PGM测序技术 原理 基于半导体芯片技术