Western_Blot中的三大问题.docVIP

Western Blot中的三大问题 想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。常遇到没有条带、背景过高等问题，没关系，请看本文的问题解答。 Question:我的结果是膜上一片空白，为什么呢? A:导致这种结果的因素很多。 胶和膜放反了：如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。 转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说，蛋白越大，转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中页几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。 在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。 试剂放置太久或存放条件不正确：抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。底物应储存在-20℃。 抗体不纯或滴度太低：一抗的浓度差异很大，应该根据经验