Exp09-10植物总RNA的提取与鉴定(改)试题.pptVIP

实验九 一、实验目的 掌握提取植物总RNA的技术 学习在普通凝胶上进行RNA电泳的方法 异硫氰酸胍,SDS ?胍+?-巯基alc→RNase ?胍+SDS→蛋白变性 ?DEPC→HIS ?特定pH下溶解性不同 小麦白化苗 Biofuge Primo R,电泳设备,高压灭菌锅,研钵,剪刀,移液器及枪头,EP管,一次性手套等 药品及试剂 RNAiso Plus,氯仿、异丙醇、75%alc、琼脂糖 0.1%DEPC水: 0.1ml原液+100ml H2O,振摇过夜,湿热灭菌 试剂配制 TAE电泳缓冲液: 以DEPC水制备 20 mL琼脂糖凝胶(1%) RNA上样缓冲液: 50%甘油,1mmol/L?EDTA (pH8), 0.25%溴酚兰,0.25%二甲苯青FF 四、实验步骤 ①200mg幼芽,液氮研磨,移入EP管 ②600?l RNAiso Plus液,震荡数秒, RT放置3? ③12000g 4℃离心5?,转移上清至新EP管 ④加120?l氯仿,剧烈震荡,RT放置3? ⑤12000g 4℃离心10?,转移上清至新EP管 操作步骤 ⑥0.5ml异丙醇,RT放置8? ⑦12000g离心4℃, 8?,弃上清 ⑧0.5ml 75%alc洗涤 ⑨7500g离心3?,沉淀干燥5? ⑩加15?l DEPC水冰浴上溶解沉淀 ⑾10?l RNA样品+2?l上样缓冲液,点样 2. 琼脂糖凝胶电泳 电泳及观察 5?V/cm,电泳20? 凝胶成像观察 全程操作均戴手套 选幼嫩组织,减少淀粉类含量 研磨时,使组织保持冰冻状态 内、外源RNase活性的抑制 以3%H2O2浸泡电泳槽、胶板、梳子30? P40思考题5 在RNA提取的过程中应特别注意什么？ P81思考题7 如何判断RNA的完整性？ * 植物总RNA的提取与电泳鉴定 二、实验原理 三、材料、器具与试剂 1. 总RNA的提取 制胶(1%) ?0.2g Aga ?20ml DEPC水配置的TAE ?煮沸溶解 ?冷却至55℃ ?2?l GelStain 注意事项 五、作业 实验十二 异硫氰酸胍/酸性酚一步法,即AGPC (acid guanidinium-phenol-chloroform); RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下举行,前者不同的RNA条带也能分开,但无法判断MW; 只有在完全变性的条件下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性瓜葛; 因此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶; 在快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂糖凝胶即可; DEPC是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂,它通过与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制RNase的活性 学习利用异硫氰酸胍变性液从植物幼苗提取RNA的方法及变性电泳的定性分析; 为什么要提取RNA？目的基因的获得; RT-PCR; Northern杂交; cDNA克隆; 核酸酶保护实验; 体外翻译; 差异显示等 德国生产台式高速冷冻离心机(Biofuge Primo R) MOPS: 吗啉代丙烷磺酸; 柠檬酸钠对金属离子(Ca2+、Mg2+和Fe2+等)具有良好的络合能力; 柠檬酸钠还具有良好的pH调节及缓冲性能,它是一种弱酸强碱盐,与柠檬酸配伍可组成较强的pH缓冲剂,因此在某些不适宜pH大范围变化的场合有重要用途 提前5d浸泡小麦种子,25℃黑暗萌发; 500mg幼芽(约8根),液氮研磨成粉末状,移入1.5mLEP管,加入600 ?L预冷的异硫氰酸胍变性液 * * * 实验十二 异硫氰酸胍/酸性酚一步法,即AGPC (acid guanidinium-phenol-chloroform); RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下举行,前者不同的RNA条带也能分开,但无法判断MW; 只有在完全变性的条件下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性瓜葛; 因此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶; 在快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂糖凝胶即可; DEPC是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂,它通过与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制RNase的活性