2016年电大正式翻译.doc

石斛兰细胞分裂素氧化酶基因DSCKX1石斛兰通过mRNA差显技术，含BA的培养基我们从索尼亚石斛兰幼苗茎尖中克隆出一种新的假定的细胞分裂素氧化酶，DSCKX1（索尼亚石斛兰细胞分裂素氧化酶）。该DSCKX1基因似乎有三种剪接DSCKX1的表达。在DSCKX1转基因超表达的兰科植物中，细胞分裂素氧化酶活性水平升高伴随着细胞分裂素含量降低。降低愈伤组织能力。内源细胞分裂素含量因此DSCKX1(Skoog and Armstrong, 1970; Mok, 1994)。因此，了解植物细胞中细胞分裂素的生物合成和代谢，对更好的理解调控激素水平平衡的植物生长。最近已在拟南芥中腺苷酸异戊烯转移酶(Kakimoto, 2001;Takei et al., 2001)。并且已经从拟南芥和小立碗藓(Moffatt et al.,1992; Schnorr et al., 1996; von Schwartzenberg et al., 1998)。有几个与细胞分裂素代谢相关的过程已被确定，主要包括特定葡糖基转移酶介导的N -糖基和O -糖基N6 -侧链裂解(Letham and Palni, 1983; Brzobohaty et al., 1994) 。目前已分别从艾叶、菜豆和玉米中克隆出三个编码O-木糖基转移酶、O-葡糖基转移酶和顺式玉米素O-葡糖基转移酶的基因(Martin et al., 1999a, 1999b; 2001)。细胞分裂素氧化酶，唯一已知的作用自然发生细胞分裂素失活植物酶(Hare and van Staden, 1994; Jones and Schreiber,1997)被认为是在植物发育过程中内源性细胞分裂素的关键点已经从玉米中分离出第一细胞分裂素氧化酶基因（CKX），它编码糖基化蛋白含有一个(Houba-Hérin et al., 1999; Morris et al., 1999)。随后，在拟南芥(Bilyeu et al., 2001)。 CKX在苔藓原生质体(Houba-Hérin et al., 1999)酵母(Morris et al., 1999)重组蛋白，包含一个共价结合黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）黄素蛋白，玉米CKX是相同的拟南芥CKX基因转基因烟草植株(Werner et al.,2001)。尽管在过去几年里取得了进展，尽管在兰科植物发育调控中细胞分裂素生理的信息，包括细胞分裂素的分子机制还知之甚少(Lakshmanan et al., 1995)和兰花基因转化体系的改进(Belarmino and Mii, 2000; Yu et al., 2000, 2001)都将对这一研究起到积极的促进作用。 为了研究苄氨基嘌呤（BA）基因差异表达我们通过mRNA差异显示分析方法(Liang and Pardee, 1992)分离基因编码一个假定的细胞分裂素氧化酶，DSCKX1 (Dendrobium Sonia Cytokinin Oxidase gene)。通过检测表达方式和分析DSCKX1基因水平的改变石斛(Knudson, 1946)中，培养基中添加2% w/v蔗糖、15% v/v椰子汁，加或不加25 μM BA。 差异显示分析 (Yu and Goh, 2000a,b)。根据制造商提供的说明，差异显示分析采用Clontech公司25 μM BA条件下的茎尖（6周龄）RNA总量被用于差异显示分析差异显示条带的克隆如前所述(Yu and Goh, 2000a)差异表达克隆（ba91）测序，作为探针筛选cDNA文库cDNA文库的构建及筛选Poly (A)快速提取mRNA试剂盒（Strategene）Poly (A+) RNA。然后根据制造商提供的说明，利用ZAP-cDNA Gigapack? III Gold克隆试剂盒(Strategene公司) 构建了一个cDNA文库。该文库（约600,000平板）由Digoxigenin(DIG)标记ba91基因探针低严格筛选得到。 D. Sonia石斛细胞分裂素氧化酶基因组序列(Carlson et al., 1991)从D. Sonia石斛的叶片中提取基因组DNA。通过PCR扩增DSCKX1基因组序列。两个扩增引物分别是从DSCKX1 cDNA两端克隆的到的5′-ACC TTC TAG CTA CTC TCT TTG CCG TCA-3′和5′-GAT TAG TGA TCA GAG AGA CAA AGC TC-3′引物。 5′端快速扩增cDNA法(RACE) 根据提供的说明协议，我们利用SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech公司）5′-RACE。5′-RACE PCR是先后与两个反向DSCKX1基因特异引物GSP1(5-GCT CT