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PCR原理与应用 Principle and application of PCR 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 目录 PCR原理 应用 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。 05 01 02 03 04 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 PCR五要素 模板 Mg2+ 引物 原料dNPT DNA聚合酶 单、双链DNA均可，一般为双链。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 （1）模板 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （2）引物浓度 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （4）dNTP （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 变性 退火 延伸 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 主要步骤 变性 退火 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 复性 模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5’-------- ----------5’ 3’-------- ----------3’ 变性、退火 变性、退火 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 循环参数 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 变性 94oC 20-30秒 延伸 70-75℃,一般为72℃ 循环次数 25至35 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性 延伸时间由扩增片段长度决定 次数过多： 扩增效率降低 错误掺入率增加 延伸。。。 PCR技术在不断进化，而种类也会越来越多。。。 1）不对称PCR(asymmetric PCR) 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型应用 2）、逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) RT-PCR先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板加入dNTP和两种特异引物及Taq酶进行PCR反应，这样低丰度的mRNA被扩增放大易于检测。 RT-PCR中的关键步骤是RNA的逆转录，要求RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂质。 RT-PCR图解 3）、锚定PCR(anchored PCR, A-PCR) 该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因配对互补结合后进行PCR扩增。 4）、反向PCR (inverse PCR, IPCR) IPCR是扩增未知序列的一种简捷方法。其基础是：用限制性内切酶消化DNA，然后环化切割的产物，再用切割后已知序列上两端相反方向的引物序列进行PCR (图8-3)，也可将环化DNA线性化后再进行PCR。 5）、随机引物PCR (arbitrary primer PCR, AP-PCR) RAPD建立在PCR基础之上，它是利用一系列不同的随机排列的寡核苷