医学免疫学实验Djp1免疫学实验课1沉淀反应要点.pptVIP

* 免疫学诊断、沉淀反应 * 实验室安全－门窗、水、电、火源 实验结束后关闭门窗、水、电、火源 酒精灯和易燃物的使用注意事项；棉塞着火须报告老师 电源－空气开关 水的使用 实验室安全－生物安全 白大褂的穿着要求 不得将实验无关物品带入实验室 不得在实验室内饮食 不得擅自开UV灯 污染及潜在污染物品须进行消毒处理 实验室规则－要点 * 实验课要求 遵守上述规则 必备物品：实验指导、实验报告、红蓝铅笔、白大褂 注意保护自己、爱惜实验室仪器和设施 按照实验要求，认真完成实验并如实记录实验报告 实验结束后整理本组的台面 实验废弃物分类（污染/潜在污染物、普通废弃物）放置； 在确认普通废弃物没有着火隐患后，倒入垃圾桶 实验室规则－要点 * 值日生的职责： 检查实验台面的整理 整理实验室及垃圾 关闭所有非必需的电器和电源 逐一检查并确认水槽水龙头的关闭 关闭窗、门 最后离开实验室 实验室规则－要点 * 单向免疫扩散 (讲解) 双向免疫扩散试验（操作） 3. 对流免疫电泳（看示教结果） 本次实验内容 * 在半固体琼脂中进行： ★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 沉淀反应（原理）: 可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液、组织浸液、微生物蛋白等）与相应的可溶性抗体，在一定的抗原抗体比例下，在一定离子浓度的缓冲体系中，发生反应，出现沉淀物，称沉淀反应。 在液体中进行： ★免疫比浊法：浊度仪（分光光度仪/酶标仪） * 3. 可见性: --取决于抗原-抗体的浓度和比例； （1）足够的浓度： （2）适宜的比例： 最大的抗原-抗体复合物的出现 （白色沉淀） 2. 可逆性：非共价键；温度、酸碱度、离子强度；（见后） 1. 特异性：抗原表位---抗体可变区，特异性越强---亲和力越强 抗原抗体反应的特点 4.抗原抗体反应的二个阶段： i: 特异性结合阶段：快 ii: 可见反应阶段：数分钟---数日 * (三) 影响抗原抗体反应的因素 1.温度： a: 分子热运动，温度越高，反应越快； b: 非共价键；蛋白质变性 c: 一般最适温度为37℃ d: 4℃，过夜 2.电解质： a: 蛋白质， 两性分子 b: 离子强度，盐析 c: 常用0.85%生理盐水 3.pH： a: 一般最适pH6-8 b: 假阳性：等电点时，电荷为零, 沉淀/凝积 * (1)单向免疫扩散 定量分析 方法: （1）琼脂42-50℃溶化，加入已知浓度的抗体，混匀，倒板，冷却，凝固，打孔 （2）孔中加待测抗原， （3）37 ℃ ，扩散； 比例合适时，出现白色沉淀环， （4）测定沉淀环直径。 （5）根据标准曲线（方程），计数待测抗原的浓度。 已知浓度的抗体 琼脂中含有 制作标准曲线： 已知的不同浓度的抗原 y = k.x + b 赵x 钱x 孙x 李x 周x 郑x * 制作标准曲线： 5μM 10μM 20μM 40μM 80μM 160μM eg: 2μM 适宜的比例 已知抗原的不同浓度 5μM 10μM 20μM 40μM 直径 2μM * (2)双向免疫扩散 抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由扩散; 相遇后，在比例合适处，形成沉淀线。 **抗原或抗体的定性和组成分析。 抗原 抗体 抗体 抗原 * 根据沉淀线的形状，可鉴定两样本的抗原是相同、部分相同或完全不同 如果Ag1和Ag2, 迁移率（浓度/分子大小）不同，如何？ 多克隆抗体（Ab-1,2,4） 多克隆抗体（Ab-1,2,4） 多克隆抗体（Ab-1,2,4） 多克隆抗体（Ab-1,2,4） * (3)对流免疫电泳 检测血清中AFP（甲胎蛋白） 1、3孔加抗AFP抗体 2孔，AFP阳性对照血清 4孔，待检血清 pH 8.6巴比妥缓冲液 1 2 3 4 + - 抗体 阳性对照 待测血清 * Ab Ag 电场力 pH8.6 pI～7.5 pI～4.8 琼脂糖：