2013级动医预防兽医实习5-多聚酶链式反应(PCR)技术-20151210课程.pptVIP

特异性强 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 七、PCR特点 八、注意事项 1、污染 PCR能够从极少的样品中，分离出其中的DNA作为模板，对其特定的序列进行大量的扩增。如果样品污染了，特别是扩增系统化中混入了以前扩增的靶序列，将会与样品一样大量扩增，使实验结果难以区别。 2、设对照实验。即除不加入模板DNA外，实验的全过程与本实验完全相同的条件同时进行，对照试验不出现扩增电泳带，说明PCR操作过程没有受到污染，反之，说明已污染。。 八、注意事项 3、隔离操作 PCR扩增仪应与PCR操作场所分开。操作中应戴未污染薄胶手套，所用的试剂及操作仪器应尽可能放在专用柜中。 4、试剂的配制 分装与保存都应在无PCR产物的环境中进行。引物的合成与纯化也要在无PCR产物的环境中进行。试剂分装的量与浓度应与操作用量应基本一致，避免再次分装造成污染。 5、使用PCR专用加样器 PCR专用的微量加样器不可兼做另用。EP管和枪头也应用新品。移液时应慢进慢出，不能过快。 猪伪狂犬病免疫荧光实验 猪伪狂犬病免疫荧光实验 聚合酶链式反应技术 （Polymerase chain reaction， PCR） 1.学习掌握PCR反应原理;2.掌握PCR技术的操作过程;3.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 一、实验目的 二、实验材料 (一)试剂： 1、DNA模板2、dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷）,包含dATP, dGTP, dTTP, dCTP。3、10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 4、rTaq酶 5、上、下游引物 上游引物: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3` 下游引物: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3`6、琼脂糖7、DNA相对分子质量标准物8、吸头、PCR管和EP管等。 二、实验材料 （二）器材 PCR仪,电泳仪,电泳槽, 微量移液器，凝胶成像系统等 三、PCR技术背景 1953年，DNA被发现是细胞里的携带遗传信息的分子。 1971年，Khorana等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1973年，台湾女科学家钱嘉韵分离出耐热的Taq聚合酶。 1985年, 美国Kary Mullis发明了PCR技术,并在science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年, Kary Mullis荣获1993年诺贝尔化学奖。 凯利·穆利斯 (Kary Banks Mullis) 四、实验原理 PCR技术是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝，PCR技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命.目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。 PCR 基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。 四、实验原理 PCR三个基本反应步骤： 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。 2.退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合； 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。 四、实验原理 PCR技术的原理： 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。 四、实验原理 1 2 3 4