1PCR原理答案.ppt

PCR扩增反应的精确性 脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs） 无扩增产物 巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR （HotStart PCR） 使用PCR增强剂 脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs） dNTPs的标准使用范围：20 - 200 mM 特异性的改进：降低dNTPs的浓度，但要注意Mg+2的摩尔浓度 有效性的改进：对于较大分子量的模板，应适当提高dNTPs的量 如果一种dNTP的浓度过高，它就会优先掺入到延长链中，造成 扩增产物的不准确，因此要保持四种dNTPs的一致。此外，保 持四种dNTPs的浓度略高于DNA聚合酶对各种dNTPs的Km值也 很重要（10-15 mM）。 也应同步降低。 准确性的改进：降低dNTPs的浓度，但要注意Mg+2的摩尔浓度 也应同步降低。 中山大学药学院 Mg+2离子 Mg+2的标准使用范围：0.5 - 10 mM 特异性的改进：降低Mg+2浓度，但要注意过低的Mg+2浓度又会影 有效性的改进：提高Mg+2浓度，但过量Mg+2将导致非特异性扩增 游离的Mg+2离子浓度应高于dNTPs总浓度0.5-3.0mM。由于Mg+2 能与dNTPs形成可溶性的复合物，过低浓度的Mg+2离子将会影响 dNTPs的有效浓度。Mg+2的浓度影响扩增产物的特异性、引物退 火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此， PCR反应系统的主要优化参数是Mg+2的浓度，尤其当扩增产物大 大于1kb时，这个因素显得更为重要。 响扩增产物的产量。 中山大学药学院 预热变性温度和时间 预热温度和时间的标准使用范围：92 - 96℃ 30 secs - 10 mins 在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的蛋白酶和核酸酶，同时 又能保证模板的完全变性，尤其是基因组DNA直接作为模板使用 时，更显得重要。 变性温度和时间的标准使用范围：92 - 96℃ 30 - 120 secs 中山大学药学院 退火杂交温度和时间 退火温度和时间的标准使用范围：37 - 65℃ 10 - 120 secs 退火时，引物迅速杂交。不同DNA聚合酶所拥有的Tm值的差异 会改变有效的引物退火温度。 特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高2-5℃）； 减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量， 只会增加非特异性引物杂交的可能性。 中山大学药学院 延伸聚合温度和时间 延伸聚合温度和时间的标准使用范围：72 ℃ 60 - 120 secs PCR扩增反应中普遍使用的DNA聚合酶的聚合速度每秒至少50 个碱基，所以如果PCR扩增产物长度小于400 bp，聚合时间可以少 于15秒，特别是当退火温度选得较高的时候，在退火阶段就有一些 单体掺入。较长PCR产物的扩增需要相应延长反应时间，但最好要 比理论计算时间更长些，以弥补由于反应系统粘度增大所产生的反 应滞后作用。 中山大学药学院 循环次数 在一定的循环次数下，PCR反应的最终产量可由下式估算： 由上式可以看出，PCR产物呈指数扩增，但当然产物拷贝数达到1012（阈值）时 产物的扩增速度一般急剧下降。达到这个阶段所需要的循环次数可由下式计算： 影响上述扩增阈值的主要因素包括： 扩增底物（引物和dNTPs）有效浓度的下降 Nf = N0 X 2 N 其中N为循环次数，N0为起始拷贝数，N0为最终拷贝数 Nf = N0 （1 + Y）N 非特异性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用 反应试剂的稳定性 扩增产物抑制作用 高浓度产物的退活作用以及不完全变性 特异性的改进：降低循环次数，减小扩增片段长度。 有效性的改进：对于1kb以上片段的扩增，增加循环中各步骤的滞留时间。 反应体积 反应体积的标准范围：20 - 100 ml（0.5 ml的小离心管） 有效性的改进：增加反应体积以及保温时间，以充分保证热平衡； 5 ml的反应体积也有成功的例子。反应体积过大会影响加热和冷 却，而过小的反应体积又容易导致温度变化不稳定，进而降低产 量，甚至反应管的几何尺寸、管壁厚薄、扩增仪的加热冷却装置 也能影响各循环步骤所需的时间。 对于100ml以下的反应体积还应该用油封顶，以减少反应体系的 蒸发浓缩效应。 中山大学药学院 PCR仪－热循环仪 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 4 PCR常见问题分析及解决策略 中山大学药学院 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DN