02-硕士生课-现代生物技术-刘柱.答案.pptVIP

基因工程 按照人们的愿望（人为的），进行严密的设计（类似工程设计），通过体外DNA重组（非生命活动过程）和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。 基因工程突出的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移 基因工程的主要理论依据 不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) 基因是可以从DNA上切割下来的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的(绝少数除外) 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代 基因工程的基本技术路线 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 重组DNA技术中常用的工具酶 核酸酶分类 核酸内切酶：催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键 核酸外切酶：从DNA或RNA链的一端逐个水解下 单核苷酸 Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 与I型及III型核酸内切限制酶不同，II型核酸内切酶只有一种多肽，并通常以同源二聚体形式存在。 它具有三个基本特性： a.? 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b.? 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c.??因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。 识别位点 绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。 1）有些识别序列是连续的(如GATC)， 2）有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N是代表任意一种核苷酸碱基。 识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。 核酸内切酶Restriction endonuclease GGATCC CCTAGG Bam HⅠ 限制性内切酶的命名 Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 限制性内切酶识别序列的特征 1）每一种酶都有各自的特异识别序列 2）识别序列具左右互补对称(Pst I: GAATTC) 3）同位酶对切割的序列甲基化有不同的 限制性反映 4）同位酶、同裂酶、同尾酶 酶切特点 同位酶：识别相同序列切点不同。 同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。Sal I（5`-G ??TCGAC-3`）和Xho I(5`-C ?TCGAG-3`)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。 Questions 1基因工程的主要理论依据:共6点 2核酸内切酶识别序列的规律 3限制性内切酶的命名 4同位酶、同裂酶、同尾酶 识别相同序列切点不同 识别位点相同，酶的来源不同。 识别位点不同，切出片段有相同末端序列。 粘性末端：产生的 DNA片段末端的一条链多出一至几个核苷酸。3′端比5′端长的称为3′粘性末端，5′端比3′端长的称为5′粘性末端