细胞生物学-外泌体文献汇报要点.pptVIP

人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究 本研究旨在探讨正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)分泌的外泌体(exosome)免疫调节功能及支持血管形成能力。 结论：BMMSC分泌外泌体具有免疫调节功能与支持血管形成作用。 背景知识 外泌体(exosome)为微小囊泡，直径大约20—140nm，在生理或病理情况下，由多种细胞内膜(endosomal membrane)以出芽方式形成的多泡体，参与细胞间的信息交流，并参与到多种生理病理过程中。来源于不同的组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，而且还包含其行使功能的关键分子。 间充质干细胞(MSC)，具有高度自我更新能力与多向分化潜能的多能干细胞，目前已应用于临床治疗心肌损伤性疾病、神经损伤性疾病等等。外泌体的主要功能是进行信息传递，因外泌体的特性与其来源细胞有关，现有研究已证明MSC分泌的外泌体在减少心肌损伤范围、保护急性肾小管损伤、促进神经再生、减少肺损伤等方面有重要作用。间充质干细胞具有独特的免疫调节功能，可抑制多种免疫细胞的功能，如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等分泌免疫调节因子，如IFN-γ、PGE2等。人骨髓间充质干细胞(hBMMSC)分泌的外泌体功能与其分泌细胞的功能息息相关，因此推测其在免疫调节与血管形成方面亦有重要作用。 主要实验流程 骨髓间充质干细胞的分离及培养 外泌体的分离 外泌体的鉴定 外泌体miRNA提取及RT-PCR扩增反应 混合淋巴细胞实验 PKH26荧光标记外泌体观察与HUVEC间相互作 用 HUVEC网状结构形成实验 Matrigel体内成血管实验 统计学处理 HUVEC：人脐带静脉内皮细胞 Matrigel：基底膜基质 正常献髓者骨髓约5ml 无菌抽取 密度梯度离心法 骨髓单个核细胞 DF12完全培养液 重悬分离 接种于培养瓶中 收集第4至第6代细胞 DF12完全培养液：DMEM/F12、10％胎牛血清、2umol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/链霉素 骨髓间充质干细胞的分离及培养 外泌体的分离 血清 4℃过夜离心 DF12完全培养液(EFM) 不同数量的BMMSC 提取外泌体 PBS重悬 -20℃保存 共培养24 h 收集上清 PBS：磷酸盐缓冲液 外泌体的鉴定 分离纯化外泌体10ul 等体积PBS 稀释 2 mm的载样铜网 静置l min 3％(w/v)磷钨酸钠溶液(pH 6.8)室温负染5 min 双蒸水轻轻洗一遍 室温晾干 透射电子显微镜观察并照相 15ug外泌体 5×loadding buffer 75℃、5 min SDS凝胶 跑胶1.5 h 检测CD9表达 转膜 混合淋巴细胞实验 外周血15 ml 密度梯度离心法 单个核细胞 RPMI 1640完全培养液 重悬 终浓度5ug/mL植物血凝素(PHA) 5 ng/ml重组人白介素2(rhIL-2) 96孔板 加入BMMSC外泌体 37℃、5％CO2 培养72 h 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中IFN-γ的含量 实验结果 (1)外泌体鉴定结果与定量 在透射电镜下观察到BMMSC外泌体呈圆形或椭圆形，直径约60—160 nm(107．22±33．56)，有完整胞膜结构，内含低密度物质。western blot证实其表达外泌体表面标志CD9(图1)。细胞分泌的外泌体量与接种细胞数呈线性关系(图2)。 图1 图2 RT-PCR结果显示，BMMSC外泌体内含有miR301、miR-let-7a与miR22(附表)，而这些miRNA均与免疫相关。BMMSC外泌体用ELISA试剂盒无法检测出其含有IFN-γ(结果未列出)，而与105/孔PBMNC共培养72 h后，对照组IFN-γ分泌量为(210．94±23．32)ug，实验组IFN-γ分泌量为(109．14 4-21．25)ug，两者间差异有统计学意义(P0．01)(图3)。此结果表明BMMSC外泌体能抑制PBMC产生和分泌IFN-γ。 (2)外泌体免疫功能 图3 在共聚焦显微镜观察可见外泌体被HUVEC摄取并分布在细胞核周围(胞浆)(图4)，在两者共培养时BMMSC外泌体明显促进HUVEC网状结构的形成，对照组为(4579．00±358．38)，实验组为(9149．67±470．70)，结果有统计学意义(P0．01)(图5)在裸鼠体内实验中，在外泌体组可明显见到血管生成，对照组无肉眼可见血管生成(图6)。 （3）外泌体支持血管形成 图4 图5 图6 在两者共培养时BMMSC外泌体明显促进HUVEC网状结构的形成，对照组为(4579．00±358．38)，实验组为(9149．67±470．70)，结果有统计学意义(P0．01)(图5)。