丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备1要点.ppt

2、一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 3、聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。 4、配制5%成层胶5ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。 H2O 3.4ml 30%凝胶贮备液 0.83ml 1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸胺 0.05ml TEMED 0.01ml 5、在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3min。 6、成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。 7、加样 8、电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。 9、取下凝胶，固定、染色或进行Western blot分析。 任务1 SHMT电泳制备方案的制定 简介 凝胶聚合原理及相关特性 SDS影响因素 电泳原理 试剂配制 器材准备 操作步骤 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂又称为共聚体的N, N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE）。 与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。③对pH和温度变化较稳定。④几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。⑤样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。⑥凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。⑦分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。 2．凝胶孔径的可调性及其有关性质 （1）凝胶性能与总浓度及交联度的关系：凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。通常用T%表示总浓度，即100ml凝胶溶液中含有Acr及Bis的总克数。Acr和Bis的比例常用交联度C%表示，即交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数。 根据有关实验研究，可知当T%值固定时，Bis浓度在5%时孔径最小，高于或低于5%时，孔径却相应变大。为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Acr浓度，Bis和Acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液pH值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。 （2）凝胶浓度与被分离物分子量的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的分子量也不同，在操作时，可根据被分离物的分子量大小选择所需凝胶的浓度范围。也可先选用7.5%凝胶（标准胶），因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。 1. 带电颗粒的性质 净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多，直径小而且近于球状，则泳动速度快，反之则慢。 2. 电场强度（电位梯度） 指单位长度（cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压（常压）电泳100—500V，电场强度为2—10V/cm，分离时间需要数小时、数天或更长。高压电泳500—1000V，电场强度20—200V /cm，电泳时间短。有时仅需几分钟，主要用于氨基酸、肽、核苷酸。由于电压增高电流增大需要冷却装置。 3. 溶液的PH 溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度。也决定物质所带净电荷的多少。对氨基酸、蛋白质等两性电解质而言，溶液PH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，电泳速度越快。反之越慢。血清中：白蛋白pI 4.0；α2球蛋白 pI 5.06；β球蛋白 pI 5.1；γ球蛋白 pI 7.1。在pH 8.6的缓冲液中电泳时，都带负电荷，其泳动速度为：白蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白。为了利于分离蛋白质混合液，应选择一种使各种蛋白质所带电荷差异明显的pH值。 4. 溶液的离子强度 在保持足够缓冲能力的前提下，离子强度要求最小。溶液离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常选择在0.05—0.1mol/l 之间。缓冲溶液离子强度可通过下列公式计算：I=0.5ΣcZ2；I — 溶液的离子强度； c — 离子浓度； Z — 离子价数。如:0.154 mol/l 的NaCl溶液的离子强度。I=0.5（0.154﹒12+0