实验六-酶切要点.ppt

实验六、酶切 一、限制性内切酶酶切实验原理 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。一般是在原核生物中发现，它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入，但对自己的DNA却无损害作用。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，在DNA片段的5’端为P，3’端为OH。 二、限制性内切酶类型 第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段。 第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。 酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸 识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴 第二类内切酶 同尾酶；切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。 这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。 由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制性内切酶所识别。 同裂酶；有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可能不同，识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。 三、酶切效率影响因素 DNA纯度 缓冲液 温度条件 限制性内切酶本身 大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响 四、使用限制酶注意事项 当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。 若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 五、利用限制性内切酶克隆 克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。 酶切位点（内切酶的识别序列）要加在引物的5‘端 具体为：5-保护碱基+酶切位点+引物序列-3 pMD?18-T Vector的结构 酶切技术 重组质粒DNA插入片段800bp 本实验所用限制性核酸内切酶为BamH I和Hind III 磷酸二脂键断裂 1、酶切体系的配备 在一无菌1.5ml Eppendorf管中加入 轻轻混匀，12000rpm离心5sec。 2、37℃水浴1h。 3、将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。 4、12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。 5、取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100V30～60min。 6、结果观察 酶切反应步骤 酶切反应体系(50μl) 模板DNA：5μl 限制性内切酶10×Buffer：10μl (2×) 酶：各0.5 μl 去离子水：34 μl 同步双酶切 分步酶切 分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应 双酶切 操作注意事项 1.吸样量一定要准确 2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶 3.要求在冰上操作，并充分混匀， 4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。 5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。 限制性内切酶酶解中常见的问题和原因 1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。 2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。 3．DNA片段