Exp08重组质粒的酶切.pptVIP

实验八 重组质粒的酶切鉴定 一、实验目的 二、实验原理 器具和材料 ?1.5ml EP管,移液器及枪头(10、50?l) ?恒温水浴、电泳仪、电泳槽 ?重组质粒pMD18-T 试剂 1. 酶切反应步骤 ?ddH2O于EP管→10?buffer→质粒DNA→限制酶→混匀,离心5s→37℃, 50?→65℃水浴10? (1) 单酶切反应 ?BamHI (15U/?l) ?组/4人; 30℃, 50? (2) 双酶切反应 2. 凝胶电泳检测 ?0.8%Aga,30ml TAE,煮沸 ?冷却至55℃,2?l EtBr ?倒胶,插梳子,凝固20? ?2?l上样液+样品 ?100V电泳,观察 酶切失败的可能原因 不全切或基本未切 ?缓冲体系不合适 ?酶量过多 ?样品杂质含量高 DNA被降解 ?痕量DNase 注意事项 ①吸量要准确 ②最后加酶 ③冰上操作 ④勿触管盖内面 ⑤EP管盖严 五、作业 思考题P140 2、5 * 学习和掌握重组质粒的少量酶切、电泳及分析插入DNA片段的大小 ?EcoRI PstI ?BamHI单切 三、实验器具、药品 ?限制酶: BamHI、EcoRI和PstI ?酶切buffer: 10?K、10?H ?DNA marker: ?-HindⅢ ?琼脂糖,1?TAE, 上样buffer 四、实验步骤 20 0.5 10 2 7.5 需量(?l) Total BamHI DNA 10? K Buffer ddH2O 成分 0.25 0.25 10 2 7.5 需量(?l) PstI EcoRI DNA 10? H Buffer ddH2O 成分 ?EcoRI PstI (15U/?l) ?组/4人; 37℃, 50? EcoRI PstI (H型缓冲液) 上次实验提取的重组质粒pMD18-T (Apr) ①吸样量一定要准确; ②为了不使酶污染而导致浪费,最后才加酶; ③要求在冰上操作,并充分混匀; ④开启Eppendorf管时,手不要接触到管盖内面,以防污染; ⑤样品在37℃与65℃保温时,将离心管盖严,以防水进入管内造成实验失败 BamHI,10?K Buffer,15 U/?l 配制0.8%琼脂糖凝胶(30ml),加20?l EB,酶切样品全部点样,另外取10?l未酶切质粒作对照,100 V电泳,待溴酚蓝移至胶的3/4位置结束电泳; ?-Hind III digest DNA marker (50ng/?l),由于cos末端之间的结合,会影响23k和4.36k的条带,因此,电泳前热处理(60℃,5min),使Marker的电泳图像变得更为清晰 北京六一仪器厂生产的?-DNA标准DNA (250ng/?l)分子量, 为HindIII酶切产物,包括7个从560bp到23,130bp的标准DNA碱基对 *