人类基因组DNA的提取.pptx

人类基因组DNA的提取主讲人：协助者：人类基因组DNA人类基因组DNA提取的原理●哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞。人类基因组DNA提取的原理●根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。人类基因组DNA提取的原理●制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。人类基因组DNA提取的原理●SDS是一种去污剂，破坏细胞膜的脂质膜。●蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类）及脂类和胺类物质，但糖蛋白的降解物常与DNA一同沉淀下来，干扰酶的活性，消化后需要用酚、氯仿抽提纯化。●酚能变性蛋白质而且还能将变性的蛋白质溶解在其中。（加入1/3体积的饱和NaCl溶液，也可较好地祛除细胞降解物而纯化DNA，可以避免酚的污染。）人类基因组DNA提取的方法根据来源：● 从全血中提取● 从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取●从胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞中提取（常用于产前诊断）人类基因组DNA提取的方法● 从全血中提取细胞裂解液：裂解细胞膜，收集细胞核SDS：破裂核膜蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来苯酚﹑氯仿：抽提去除蛋白质无水乙醇：沉淀DNA75%乙醇：洗涤DNA沉淀真空干燥后，溶解于TE(Tris(三羟甲基氨基甲烷)+EDTA)中即得到高分量的DNA人类基因组DNA提取的方法● 从全血中提取裂解与RNase/蛋白酶K 消化1.取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。2.加入10μl 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。人类基因组DNA提取的方法● 从全血中提取裂解DNA与吸附柱结合3．用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。!注意!待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650 μl，故需每次转移上清650 μl到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。人类基因组DNA提取的方法● 从全血中提取裂解DNA的纯化4. 再加入600 μl洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。5．重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。6．小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 μl洗脱缓冲液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。7．取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组NA。人类基因组DNA提取的方法● 从口腔上皮脱落细胞中提取裂解与裂解液消化1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。2、沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350μl STE、150μl 10% SDS和10μl 20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37℃温箱过夜或50℃3~4小时。人类基因组DNA提取的方法● 从口腔上皮脱落细胞中提取裂解离心除杂质3、加等体积饱和酚（或1/3体积的饱和NaCl），轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另