新基因的克隆.docVIP

新基因克隆技术原理的概述 摘要：新基因克隆是当今生物学最热点的领域之一，为能快速而准确地克隆目的基因, 本文综述了一些基因克隆常用技术,包括功能性克隆，表型克隆，图位克隆，转座子标签技术，电子克隆等；通过从技术原理、适应性及使用例证等方面进行综述和评价，以便在实际研究中可以选用较为可行的方案。 关键词：新基因 克隆 技术原理 从上世纪70年代, 由于以限制性核酸内切酶、DNA连接酶、 逆转录酶的发现和应用及外源性DNA转化感受态E. coli.实验成功为标志的基因工程的出现, 使人们可以在分子水平对目的基因进行克隆。根据“中心法则”遗传信息的流向,克隆新基因的途径主要分为正向遗传学途径和反向遗传学途径:前者主要通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行,而后者则是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。正向遗传学途径常见的方法如传统的功能克隆(functional cloning)、表型克隆(phonetypical cloning)包括递减杂交(substractive hybridization)、差异显示PCR (DD-RT PCR)、代表性差示分析法(RDA)、抑制性扣除杂交(SSH) 等; 而反向遗传学途径则以图位克隆(map-based cloning)与转座子标签(transposon tagging )技术较为常见, 在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,上述两种方法较为常用; 同时随着现代生物信息学的发展, 电子克隆(silicon cloning)出现, 更为研究者提供了方便、迅捷的方法。 1　功能性克隆(functional cloning) 1　纯化后克隆　 若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时,可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法, 筛选阳性克隆获取其目的基因(1),除了免疫筛选方法外, 也可根据目的蛋白的生物学功能,利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得, 但纯度较高时, 可利用其中的一段氨基酸序列, 反推出其基因序列, 据此合成寡核苷酸用cDNA文库的筛选;或根据所获得的基因序列,指导5′端的引物合成,根据mRNA3′端poly-A序列指导合成poly-T的3′端引物, 用PCR 技术从制备细胞的 mRNA 或直接从胞浆内溶物物中合成相应cDNA, 将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。 1. 2　同源性克隆　 生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列,基于此原理,在其它种属同源基因被克隆的前提下, 构建cDNA文库或基因组文库,然后用已知分子高保守序列制备同源探针,经标记后从相应的文章中筛选阳性克隆,并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因,当然在没有全同源探针的情况下,可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。 2　表型克隆( phonetypical cloning) 细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下(如癌变、异常增生),常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高,而另一些基因可能表达降低或缺失,以下方法用来发现分化表达差异性基因: 2. 1　交互差减差异 RNA显示( substractive hybridization) 由Lamar 和Palmer(2)在1984 年提出,作为较早运用研究差异性表达基因的手段, 其主要思路如下: 主要过程如下:
交互差减。分别提取具有差异表达的2种组织细胞A、B的 mRNA ,反转录为 cDNA, 并构建cDNA文库。将这2个文库进行交互差减得到A减B和B减A的2个差减 cDNA文库,由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构,载体进入宿主后,其上质粒载体被切下, 得质粒cDNA文库；
差异显示。用3′锚定引物和5′随机引物对2个差减文库提取的 DNA 分别进行PCR扩增, 将扩增产物用5%序列胶电泳, 显示并分离差异条带,回收差异DNA,再次扩增后,获得富集的差异表达片段； 表达分析。采用反向Northern分析和 Northern分析鉴定经再次扩增的差异DNA片段的真伪。反向 Northern分析是将差异显示得到的扩增后DNA片段转膜,分别与来自A、B细胞系的总mRNA 经反转录制备的32P标记的 cDNA第一条链探针进行杂交,只与亲本来源细胞系杂交,而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因；
对差异片段克隆、 测序, 并进一步分离获得差异表达的基因。 2. 2　差异显示PCR( DD- RT PCR) 1992年由PengLiang和A. B. Pardee等( 3, 4)率先使用, 在核酸分子水平上显示了mRNA 表达水平的差异。其主要原理是:以某组织或细胞的全部RN A或mRNA为模板,利用以3′