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若想建立某中药的醇提取液的RPHPLC指纹图谱，是采用等度洗脱还是梯度洗脱？简述其分析条件的优化思路。 采用梯度洗脱 由于中药的醇提取液成分复杂，样品的容量因子范围窄，不能用等度洗脱。梯度洗脱可以使不同容量因子的样品成分在洗脱时随流动相的连续改变而趋于同一k’值，谱峰尖锐而对称，分离度改善，缩短分离时间，降低最小检测量和提高分离度精度，从而让所有成分均出峰。 优化思路 梯度洗脱期间，强溶剂的浓度增大，优化梯度条件有起始浓度，终止浓度，梯度时间t和溶剂的种类。因此在RPHPLC指纹图谱建立时，要考虑流动相的种类，流动相梯度范围和梯度斜率三方面。 A、流动相种类的选择：RPHPLC指纹图谱中常用甲醇、乙腈、四氢呋喃等有机溶剂与水混合，流动相种类由样品分离难易程度决定。甲醇、乙腈、四氢呋喃洗脱强度逐渐增高，样品易分离时用二元溶剂系统，不易分离时采用溶剂优化法选择流动相和水的最佳比例，调整k’值，使其在1~20（tR：3-35min）。 B、梯度范围：即起始浓度和终止浓度，一般为5%-100%（tR：30min），若谱图前段空白可提高初始浓度，末端空白可降低终止浓度，可节约时间，缩小梯度范围使所有组分短时间从柱中洗脱出来。 C、梯度斜率：根据初步分离的谱图，峰密集部位可降低斜率，减小强溶剂浓度变化速度，峰疏散部分提高梯度斜率，时间短。 根据Van Deemter方程在HPLC中的表现形式，分析在HPLC中影响柱效的因素及实验条件的选择。 （1）影响柱效的因素： 物流扩散项：为避免物流扩散而引起峰扩张，需用小儿均匀颗粒填充色谱柱。 纵向扩散项：HPLC中Dm仅有气相的10-4~10-5倍，该项可忽略。 固定相传质阻力项：降低固定液膜厚度，加快组分在固定相中的扩散。 流动相传质阻力项：组分分子随流动相进入色谱柱时，靠近固定相颗粒的部分分子流速较慢，中央分子流速较快，而引起峰扩张需要降低该项，需减小dp和u，增大Dm. 流动相滞留传质项：固定相的多孔性使部分流动相滞留于固定相某一局部，流动相中组分分子必须自流动相扩散到滞留区，才能与固定相进行质量交换。为降低该项，应采用颗粒小，微孔浅，孔径大的固定相。 （2）选择实验条件以提高柱效： 减小填料空穴深度；减小填料粒度；用低粘度溶剂作为流动相；流动相采用低流速；适当提高柱温。 简述在无参考文献的情况下，优化建立某试样RPHPLC等度分离条件的思路。 建立试样的RPHPLC等度洗脱分离的关键步骤是优化流动相，使各组分达到基线分离。 优化流动相 对于RPHPLC来说，常用流动相是甲醇、乙腈、四氢呋喃与水的配比混合物。对于三角形优化法将此三种强溶剂作为三角形的三个顶点，并用水相将三种溶剂调为同一强度，确定此三个系统后，根据两两1:1，三者1:1，又可确定其余四种流动相系统，根据这七种流动相配比，分别进行RPHPLC实验，得到7种结果，从中选出一种适合该样品的流动相。 若不用三角形优化法，可选用强溶剂以20%的浓度递减，分别作RPHPLC，从中选出合适的溶液强度，使k’在1~20（tR:30-35min）。 流速和柱温的控制： 在RPHPLC中，流速一般用10m L/min，如果分离度不好，可以适当减小流速，柱温多控制在30℃~40℃，不可超过40℃，否则会损坏柱子，若温度过低，可适当提高柱温。 简述离子对色谱的原理和反相离子色谱对色谱中影响保留值的因素。 离子对色谱的原理：通过加入合适的反离子，同离子化的试样形成离子对，这种离子对复合分子同中性或非极性分子一样，从而有可能采用分配色谱法进行分离。 （这里有个关系式）试样离子和反离子均易溶于水相，而离子对具疏水性，因而被非极性固定相提取。组分离子性质不同，离子对极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而各离子先后离开色谱柱。 反相离子对色谱中影响保留值的因素： 离子对试剂：其疏水性越强，在非极性固定相上的溶解度越大，则保留值越大，平衡离子浓度增大，利于离子对形成，保留值随之增加。 溶剂强度：流动相中水比例减少，有机溶剂增加，溶剂强度增加，k’值减小。 pH的影响：取决于溶质的性质，溶质电离强度减小将使保留时间变小。 离子强度：随平衡离子外，若流动相中还存在其他辅助离子，则使离子强度增加，组分保留值下降，离子强度加倍，保留值大致变化2~3倍。 试分析影响分离度的因素及提高分离度的措施。 （1）分离度是衡量分离效果的指标，基本分离方程： 分离度受动力学和热力学因素两方面的影响，因素有：效率因子n，选择性因子α，容量因子k’。 1）、效率因子 n ：当固定相确定以后，要使一对组分的分离达到某一分离度，柱必须具有最低限度的理论塔板数 最小柱长 ，增加柱长可以提高分离度，减小柱的H可以提高分离度，比增加柱长更可取。 2）、容量因子 k’ ：容量因子