水稻组织石蜡制片技术.docVIP

水稻组织石蜡制片流程 材料准备： 10ml离心管（或5ml离心管）、胶头滴管、真空泵、切片机、染色缸、烘箱、烘片机，镊子。 酒精、自来水、二甲苯、冰醋酸、甲醛、粘片剂（可用鸡蛋清/甘油=1/1，加防腐剂配成）、染色剂 试剂配制： FAA固定液：70%乙醇：乙酸：甲醛=80:5:5 75%、85%、95%，无水乙醇 染色缸内染液：视情况而定，可参考染色步骤。 粘片剂：鸡蛋清/甘油=1：1，再根据量加入少许防腐剂（如苯甲酸钠、山梨酸钾或潮霉素等） 处理顺序： 离心管中加固定液，材料取好后放入固定液中。 水稻叶片取下后如果不立即放入固定液中，叶片会卷起来。不要先取材料后加固定液。 一、固定 FAA固定液，真空泵抽气（至0.8-0.9间红线后再过十五分钟），过夜 注意：固定液体积至少为材料体积的5至6倍。材料体积较小时，取2ml左右。 石蜡制片不像其他分子实验那样力求精确。我的做法是将胶头滴管1ml位置沾上标签，每次吸溶液到标签附近即可，比用移液器省力许多。 脱水 75%酒精 85%酒精 95%酒精 无水酒精 无水酒精 每步处理各1h。 透明 （A：酒精 B：二甲苯 ） A/B=3/1 A/B=1/1 A/B=1/3 B B 每步处理各1h。 透明完成后，一般情况下，材料变成半透明玻璃色。 浸蜡 （B：二甲苯 C：石蜡）此步在70度烘箱中 B/C=1/1 C1 C2 C3 注意： B/C=1/1这一步尤其需要注意，因为比较幼嫩的组织遇到石蜡易皱缩，皱缩后的材料石蜡就很难透入了。解决的方法是让是让石蜡浓度缓慢升高。 二甲苯中石蜡的浓度应该慢慢升高！ 通常的方法是向有材料的二甲苯溶液中慢慢加浮蜡。 （材料与石蜡块均沉于二甲苯底部，当石蜡溶解时造成材料四周的短时局部石蜡浓度过高会造成材料皱缩变形。） 浮蜡制法： 将融化的石蜡在凝固过程中不停地快速搅动，使气泡进入蜡体内，最终凝成蜡块中容有大量小气泡，成为浮蜡。（搅到蜡快完全凝结时停下，不然就成一摊蜡屑了。） （石蜡比二甲苯密度大）因石蜡浮于二甲苯上部，不会与材料接触，所以材料不会皱缩变形。 B/C=1/1 C1详细的操作过程：（我的做法，仅供参考） B：此时材料在常温下通风橱中的离心管里。 将离心管里的二甲苯倒出，加入4ml新二甲苯。向其中加入玉米粒大小浮蜡，溶解半小时左右后，浮蜡不再溶解。盖好盖子放入七十度烘箱。浮蜡溶解后，再加玉米粒大小浮蜡，待其溶解。直至浮蜡与二甲苯总共有8ml左右。此时B/C=1/1，可以过夜。 将混合液体倒去4ml继续重复前法至8ml，此时石蜡占3/4了。假如是做的根的石蜡切片再弃去4ml，再重复一次。 5ml离心管加液量减半。但5ml离心管做根的切片不太好。 之后将镊子烧一下，将材料夹出放入盛有融化石蜡的蜡杯中。 镊子烧一下因为热石蜡碰到冷镊子，会在镊子上凝结一层固体蜡，再去夹材料会使材料粘到镊子上。包埋时也要将镊子烧一下，原因相同。 三个C的意思是三种不同熔点的石蜡，C1至C3熔点由低到高。但若实验室只有一种石蜡，可以是三份一样的石蜡，同时处理时间可短一点（但要保证二甲苯被完全置换出来）。 如果这一步处理得好，处理出来的材料还是半透明玻璃状，形状也不会发生变形。常见的问题是材料缩水。 石蜡融化后非常容易挥发，因此浸蜡过程中盛石蜡的烧杯上要罩封口膜。切记！！！ 包埋（此步最好找人演示一下） 融化的石蜡倒入蜡盒中 放入材料 蜡盒放入水中 最终的效果是，材料和石蜡凝为一个方形蜡块。 若做横切，则材料竖直放下去。若为纵切，则材料平躺着放下去。 材料放入蜡盒这一步需要非常熟练。材料从C3至蜡盒这一步要尽量减少暴露在空气中的时间，以防材料表面的蜡凝结，不能与蜡盒里的蜡很好的融合。 蜡盒是用信封纸叠的。可根据实验室里的模板比着折。折好后放在蜡里浸一浸以增加韧性。冬天或操作不熟练蜡盒做得短一些，一次只放一个材料。熟练工蜡盒可做得长一些，可同时容纳几个材料。 镊子夹材料之前烧一下。 具体步骤找人一演示就会，我也不太好说清楚。 包埋步骤将材料夹入蜡盒操作需要练习一下。 制片 修块：将含材料的蜡块修成四棱台形或长方体形。材料周围至少有2mm蜡。修块不熟练修出来很丑，不过对观察影响不大。 粘块：修好的蜡块黏在小木块上。粘块相对简单。木块最好要提前在融化的石蜡里浸一段时间，这样蜡块与木块粘得更紧。 切片：放在切片机上切片。 切片厚度随意，一般五至十二微米。太薄了蜡带起皱，太厚了蜡带打卷，都不容易切好。 粘片：将切出的蜡带放在显微镜下预先看一下，找出比较好的蜡片（待观察部分没有破洞）。将找出的蜡片放于涂有粘片剂的载玻片上。 粘片剂涂法：