生物离心-区带分离技术总结.pptxVIP

区带离心法 原理：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。 分类: A、差速区带离心法 B、等密度区带离心法 区带离心法 A、速率区带离心： 速率区带离心法依据样品中各组分沉降速率的差别而使其互相分离。在离心管中灌制好预制的一种正密度梯度介质液，在其表面铺上一层样品溶液，离心期间，样品中各组分会按照它们各自的速率沉降，被分离成一系列的样品组分区带，故称速率区带离心。 预制密度梯度介质的作用有二个，一是支撑样品，二是防止离心过程中产生的对流对已形成区带的破坏作用。但是样品液的密度一定要大于密度梯度介质的最大密度，否则就不能使样品各组分得到有效分离。 离心过程中，各组分的移动是相互独立的。因此，S值相差很小的组分也能得到很好的分离，这是差速离心法做不到的。但速率区带离心不适于大量制备实验。 注意点：?严格控制离心时间?颗粒密度大于介质密度ρpρm?事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液?不能用角式转头、只能用水平式转头?不能用刹车 分离蛋白质，RNA和核糖体这类生物大分子是比较理想的。 B、等密度区带离心法 依据粒子本身的密度差异而进行分离。如果离心管中介质的密度梯度范围包括待分离样品中所有组分的密度，离心过程中各组分将逐步移至与它本身密度相同的地方形成区带，这种分离方法称为等密度梯度离心。 在等密度梯度离心中，组分的分离完全取决于组分之间的密度差。离心时间的延长或转速提高不会破坏已经形成的样品区带，也不会发生共沉现象。 （1）用预制密度梯度的等密度离心分离方法 （2）用自生梯度的等密度离心分离方法 离心开始后, 梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。各种颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置上形成区带。 特点：（1）与样品粒子的密度有关（2）与样品粒子的大小和其他参数无关 （3）转速、温度不变,则延长离心时间也 不改变这些粒子的成带位置。 注意点：?离心时间要长?可用角式转头或水平式转头?粒子密度相近或相等时不宜用?密度梯度溶液中要包含所有粒子密度?不能用刹车 速率区带离心与等密度梯度离心的区别！ 1、依据的原理不同 速率区带离心依据粒子的沉降速率被分离；等密度梯度离心依据粒子本身的密度差异被分离。 2、介质的梯度范围不同 速率区带离心介质的密度小于样品中各种粒子的密度；等密度梯度离心介质密度大于样品各种粒子的密度。 3、时间效应不同 速率区带离心不能长时间离心；等密度梯度离心长时间离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。 区带离心法样品的加入量： ① 速率区带离心法,离心管(直径为1.0-1.6cm) 可加0.2-0.5ml左右的样品量，直径为2.5cm的离心管中加入1.0-2.0ml的样品量。 ②等密度离心分离 ：梯度的负载量，日常实验只能凭经验来判断。 优点： 有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯的颗粒，适用范围广。 缺点： 离心时间长。需要制备梯度，操作严格不易掌握。 主要应用： 分离蛋白质，酶，激素，核糖体亚基，病毒，细胞等。 密度梯度介质的选择： 1）梯度介质成份应该是惰性的； 2）梯度介质溶液的物理和化学特性应该知道； 3）梯度介质溶液不应该妨碍梯度中样品分离带 的检测； 4）容易从梯度介质中分离出样品，而不会损失 样品或使样品失活； 5）在紫外光和可见光区无吸收； 6）可以灭菌处理； 7）成份纯，能买到，价格便宜，用后能回收。 甘油、多糖、碘化物、钠盐、钾盐、铷盐、铯盐、聚乙烯吡咯烷酮等。 梯度介质材料： 梯度介质应用范围 分离区带的回收 ： 穿刺法 虹吸法 加压法 切割法 自动收集器 层层吸收法 梯度的制备 1.从低浓度到高浓度铺液 （顶替法 ） 2.从高浓度到低浓度铺液 （直铺法） 将增溶后离心得到的类囊体膜（类囊体膜上存在着PSI单体和三聚体，以三聚体为主。）铺在10%-30%不连续的蔗糖密度梯度上，蔗糖密度由上至下依次为10%，15%，20%，25%，30%。所配制的蔗糖成分中分别含Triton X-100为0.05%（m/v）。4℃超速离心15h，160000×g，转子为P40ST。 在PSI提取方法中，得不到较纯的PSI单体。所以，把增溶分散的PSI三体，通过挤出器，100nm的聚碳酸