PCR诊断的进展剖析.doc

PCR诊断的研究进展 【摘要】：聚合酶链式反应简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。自从 1986年由Mullis［1］等首次应用于遗传病基因诊断以来，已有近百种病可用PCR?技术进行诊断和产前诊断 PCR技术是聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 1.2 PCR在猪病上诊断的应用 自从1985年Kang Mullis［1］向全世界公布PCR以来，由于PCR优异的性能，短短几年内PCR已经在生物科学领域中得到广泛应用。PCR可在数小时内对仅有几个拷贝的基因放大数万倍，使其在凝胶电泳后形成明显可见的DNA条带。在PCR技术中，应用于检测FMDV、SHV、PRRSV等的有RT-PCR、荧光RT-PCR、巢式PCR、实时PCR等。宋敏等[8]建立的RT-PCR方法检测口蹄疫病毒，该法可以检出10TCD50的病毒含量，同时该方法还有较好的特异性，不与猪的其他病原发生交叉反应； PCR方法可检测病毒，也能直接检测核酸片段，样品可以是水泡液，也可以直接用扁桃体、淋巴结、肌肉、皮肤等组织，是其他方法无法代替的。但这种方法需要较高的试验设备和分子生物学技术。 通过比较上述的几种分子生物的方法可以得出基因芯片技术、核酸探针技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，这些方法有的费时、费力，有的存在非特异性反应和敏感性低等缺点，因此迫切需要一种快速、敏感、特异的方法来解决生产实际中的问题【2】。PCR技术克服了上述方法的某些缺点，具有敏感、特异、快速的优点。近年随着PCR技术的建立和广泛应用，国内外许多学者将PCR技术应用于FMDV、SHV、PRRSV等的检测，取得了十分可喜的成绩［3-5］。 2. PCR技术的改进　 2.1原位PCR技术　 原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR是Hasse［6］等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K。③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。⑤显微镜观察结果。 　 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。其特异性和敏感性高于一般的PCR连接酶链反应。 2.2应连接酶链反应 应连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。 　　连接酶链反应是Backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明，并申报了专利［7］。1988年Landegren也进行了该项研究。1988年Backman等又因分离热稳定的连接酶，而申报专利，1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶进行了LCR试验。耐热DNA连接酶可以在热循环中保持活性，提高连接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序。 LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。其程序为:在模DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度下(94～95℃)使DNA变性，双链打开，然后降温退火(65℃)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(