孙长胜-免疫与生物技术实验室研讨.ppt

免疫与生物技术实验室 09级-孙长胜 生物化学与分子生物学专业 蛋白质，酶学酶工程方向 2009203031 2011年12月 硕士期间主要研究的内容总结 按时间顺序进行如实记录，其中有一些时间段几项研究同时进行 记录主要包括如下内容：（参考本人实验记录5本，每个研究项目的PPT，及实验图片结果） 时间 内容 结果 用途 展望 实验1：lipB基因的克隆与表达 时间：2009年9月4日-2009年12月4日（三个月） 载体：pET30a-tev-rou-LipB，酶切位点 BamHⅠ，HindⅢ 菌株：DH5α和BL21菌株保存于-70℃冰箱 结果：成功纯化获得10mL高纯度LipB蛋白保存于-70℃冰箱（未使用） 用途：帮助师姐（高绪娜）用于研究LipB与LipD蛋白之间关系（未做） 实验1：lipB基因的克隆与表达 核心技术：全面学习分子生物学相关实验操作 PCR（三轮），提取质粒，琼脂糖电泳，切胶回收，酶切 连接，转化，菌落PCR，摇菌，保种，送样测序 蛋白表达，测OD值 提取周质，超声波破碎，Ni柱纯化，SDS检测 分子筛G-25脱盐，TEV蛋白酶切，离子交换柱DEAE纯化，G250测蛋白含量，分光光度计测蛋白含量 透析袋透析样品，自动部分收集装置，冷冻干燥装置 配置培养基及各种常用试剂 实验2：饲养果蝇 时间：2009年12月5日-2011年6月（一年半） 内容：向师姐（狄廷娣）学习果蝇的基本知识及管理果蝇 核心技术： 配制果蝇培养基 果蝇保种更换培养基（每月一次） 清洗果蝇保种指管 成功将所有转基因果蝇分类整理 果蝇受螨虫污染一次，转基因品系86死亡一次，成功解决。 实验3：构建载体 时间：2009年12月7日-2009年12月17日 载体： pET28b-sp-hisYeb-ACP/P→A，酶切位点NcoⅠ，HindⅢ, 构建pBAD24-sp-hisYeb-ACP/P→A, 检测pBAD24-sp-hisYeb-BCCP, 检测pBAD24-sp-hisYeb-ACP-4A/6A/8A ,4S/6S/8S 菌株：DH5α菌株保存于-70℃冰箱 结果：均成功 用途：帮助师姐（高绪娜）做实验 实验4：突变groEL基因的克隆与表达1 时间：2009年12月22日-2010年1月21日（放假前） 载体：pET30a-tev-mutGroEL，酶切位点 EcoRⅠ，HindⅢ 结果：PCR扩增出groEL后，利用定点突变技术突变第87号氨基酸。 由于操作技术的不熟练及摇种管清洗不干净（后购买超声波清洗仪），及培养基染菌，感受态有问题等多方面原因导致期间没有完成到测序正确这一实验步骤。 实验4：突变groEL基因的克隆与表达2 时间：2010年2月27日-2010年5月19日（3个月） 载体：成功构建pET30a-tev-mutGroEL，酶切位点 EcoRⅠ，HindⅢ 菌株：DH5α和BL21相应菌株保存于-70℃冰箱 结果：成功获得上述菌株，成功进行融合蛋白表达纯化，成功进行TEV蛋白酶酶切，最后获得目的蛋白失败。 该融合蛋白表达量很大，Ni纯化效果好，TEV蛋白酶能酶切，但分子筛和离子交换柱纯化导致降解，原因不明。之后Ni柱，分子筛，离子交换柱再生后，多次重复试验后结果相同。 至此纯化该目的蛋白实验失败！ 实验5：birA基因的克隆与表达 时间：2010年3月15日-2010年4月17日（一个月） 载体：pET28b-His6-BirA，酶切位点NcoⅠ，HindⅢ 菌株：DH5α和BL21相应菌株保存于-70℃冰箱 结果：成功纯化获得8mL高纯度BirA蛋白保存于-70℃冰箱（未使用） 用途：帮助师兄（陈南）用于BirA的表达情况研究及pBAD34-hisbirA与含有BCCP的质粒共表达情况的研究 核心技术：常规构建质粒，常规表达纯化（表达量大，易纯化），分子筛脱盐后保存 实验6：构建载体 时间：2010年4月11日-2010年5月17日（1个月） 菌株：DH5α及JM109相关菌株保存于-70℃冰箱 结果： 成功获得含pBAD24-sp-hisMBP-ACP，pBAD24-sp-hisYeb-ACP的菌并制备相应感受态， 成功获得菌pBAD34-ACPS质粒, 成功转化获得上述两种双质粒菌株， 成功构建pBAD24-sp-hisMBP-ACP（突变），pBAD24-sp-hisYeb-ACP（突变）质粒， 成功表达，提周质，SDS检测 三种JM109菌株的pQE-sp-hisYeb-sulf原始菌及基因敲除菌。 用途：帮助师姐（高绪娜）师兄（陈南）用于大肠杆菌分泌表达的研究实验。 实验7：果蝇理论